一种从菲律宾蛤仔黏附细菌Halomonas sp.GHF11 中提取的多糖絮凝剂的表征其在脱色中的应用

穆 军，蒋广宁，陈 荫

（浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022）

絮凝剂广泛用于工业废水处理、饮用水处理、脱色、重金属去除、采矿业和纺织业等[1]。絮凝剂可以使液体中的胶体颗粒形成较大的颗粒以沉降，因此可用于去除污染废水的浊度和悬浮固体等。然而无机絮凝剂和合成类絮凝剂的大量使用，对环境产生了二次污染，微生物絮凝剂应运而生。与传统絮凝剂相比，微生物絮凝剂有安全，无毒，环保且用量少等优点[2-3]。生物絮凝剂的组分主要包括蛋白质、多糖、核酸和纤维素，其中多糖是主要组分[4]。由于多糖化学结构的多样性，人们对胞外多糖的微生物活性进行了许多研究[3-5]。胞外多糖是由细菌和其他微生物分泌的细胞外聚合物，并且在许多方面表现出良好的活性，例如絮凝和脱色。然而，获得纯多糖产品成本高，产率低，发酵过程长，限制了其广泛应用。因此探究其中的作用机制，将有利于通过人工合成、生态仿生等途径来降低絮凝剂的生产成本，促进微生物絮凝剂的发展。

菲律宾蛤仔对海水有着特殊的絮凝效果，推测絮凝效果与蛤仔黏附污泥中的微生物有关。实验室前期从黏附污泥中筛选出14 株絮凝活性菌株，选取菌株Halomonassp.GHF11，从其发酵液中提取细胞外多糖，并通过柱层析纯化多糖进行结构表征。该多糖有约70%的絮凝率外，对染料孔雀石绿的脱色率可达90%。研究表明，多糖是发挥絮凝作用的主要活性物质。通过分析多糖的单糖组成、糖苷键连接方式来探究化学结构与优异性能之间的相关性，有助于理解絮凝机理并充分发挥其潜在的应用价值[6]。

本文从絮凝活性菌株的发酵液中提取微生物多糖，通过柱层析纯化获得多糖纯物质，并通过一系列分析对纯化的多糖进行结构表征，包括单糖组成、红外光谱分析、分子量测定、甲基化分析，对其结构的研究有利于对海洋微生物资源利用，并为新型微生物多糖的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株Halomonassp.GHF11 是从菲律宾蛤仔黏附污泥中筛选获得，具有较高的絮凝活性。

主要试剂：乙醇、硫酸、苯酚、氯仿、正丁醇、三氟乙酸（TFA）、二甲基亚砜（DMSO）、CH3COOH、吡啶为国产分析纯，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）和乙腈（HPLC 级），12 种单糖标准品：D-鼠李糖、D-核糖、D-甘露糖、D -葡萄糖、D-氨基半乳糖、L-岩藻糖、D-葡萄糖醛酸、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-半乳糖、D-氨基葡萄糖、D-半乳糖醛酸。

菌株GHF11 用以下培养基（g·L-1）培养：K2HPO4，5；KH2PO4，2；CO（NH2）2，0.5；（NH4）2SO4，0.2；酵母提取物，0.5；葡萄糖，20；溶于1 L 人工海水（ASW）中，初始pH 为7.5。

人工海水组分（g·L-1）：MgCl2·6H2O，9.68；KCl，0.61；Na2SO4，3.47；NaCl，30.0；Na2HPO4，0.014；NaHCO3，0.17；CaCl2·2H2O，1.36；KBr，0.10；SrCl2·6H2O，0.04 和H3BO3，0.03。

1.2 菌株的发酵及多糖的提取

将GHF11 接种到500 mL 的烧瓶中，每瓶150 mL，于115 ℃高压灭菌30 min，并在28 ℃，180 r·min-1培养4 天。使用乙醇沉淀法从发酵液中提取胞外多糖粗品[7]，将培养液（6 L）高速离心除去菌体及代谢物，用旋转蒸发器浓缩上清液至初始体积的1/10。浓缩液透析后，三倍体积的无水乙醇缓慢加入其中，充分混合后于4 ℃下放置过夜，离心收集产生的粗多糖沉淀物。将多糖重新溶解在去离子水中，等体积的Sevag 试剂（其为氯仿和正丁醇（4：1,V：V）的混合溶液）加入到粗多糖溶液中，充分混合，放置30 min，离心以除去其中蛋白质。将上层水相浓缩并冻干，得到脱蛋白粗多糖。

1.3 胞外多糖的纯化

粗多糖的纯化采用JIANG Changxing,et al[8]的方法并稍作修改。将粗多糖重新溶解于5.0 mL 去离子水中，上样到DEAE-52 纤维素柱（2.5×30 cm），用0、0.1、0.3、0.5 mol·L-1的氯化钠溶液以1.0 mL·min-1的流速梯度洗脱。用自动收集器以5 mL/管收集洗脱液。通过苯酚-硫酸法测定多糖，并绘制洗脱曲线[9]。合并相同组分，透析并浓缩。随后，使用Sephadex G-100 凝胶渗透色谱柱（1.5×50 cm），用去离子水以0.2 mL·min-1的流速洗脱，进一步纯化浓缩的组分，收集同一洗脱峰下的级分，浓缩冻干后得到多糖纯品。

1.4 絮凝活性的测定

使用高岭土悬浊液测定絮凝活性[10]。在250 mL 烧杯中依次加入93 mL 高岭土悬浊液液（4 g·L-1），5 mL CaCl2（10 g·L-1）和2 mL 多糖溶液，调节pH 至7.5，将混合液在180 r·min-1下剧烈搅拌1.0 min，60 r·min-1下缓慢搅拌2.0 min，最后静置10 min，用分光光度计测量上清液在550 nm 处的吸光度，使用2 mL 去离子水作为空白对照，所有操作平行3 次，絮凝率通过以下公式计算：

FR 代表絮凝率；A 和B 分别是对照和样品的吸光度值。

1.5 脱色活性的测定

脱色活性的测定参照文献[11]，脱色率表示为DC。对3 种染料进行脱色实验，包括亚甲基蓝，结晶紫和孔雀石绿。移取1 mL 的原液（400，400，1 000 mg·L-1），稀释至100 mL，调节体系pH 7.5～8.0，加入1 mL样品溶液，然后将混合物缓慢搅拌1 min 并静置1 h，以9 000g 离心10 min，分别测量3 种稀释溶液在660、580 和620 nm 处的吸光度，用去离子水作为参比。脱色活性计算公式如下：

其中DC 代表脱色率；A0和A 分别是对照和样品的吸光度值。

1.6 单糖组成分析

利用HPLC 分析多糖的单糖组成，参考文献[12]。将200 μL 多糖溶液（2g·L-1）和200 μL 三氟乙酸（2 mol·L-1）在安瓿瓶中混合于110 ℃水解4 h。安瓿瓶冷却至室温后，加入500 μL 甲醇并在旋转蒸发器上蒸发至干，重复加入3 次以除去残留的三氟乙酸。然后将干燥的水解样品溶解在200 μL 氢氧化钠（0.3 mol·L-1）中，与200 μL PMP 甲醇溶液（0.5 mol·L-1）充分混合，在70 ℃下反应100 min。冷却至室温后，加入200 μL 盐酸（0.3 mol·L-1）中和。随后，加入二氯甲烷（1.0 mL）萃取数次以除去PMP。用0.45 μm 微孔滤膜过滤，用于HPLC 分析。同时，混合单糖标准品的衍生化过程在相同条件下进行。PMP 单糖衍生糖的分析在配备有光电二极管阵列检测器（Agilent HP 1100，Agilent Technologies，USA）的HPLC 系统上操作。

色谱条件：色谱柱，Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6×250 mm，5 μm，Agilent Technologies，USA）；柱温，30 ℃；流动相，磷酸盐缓冲盐（0.1 mol·L-1，pH 6.7），比例为17.8%（V/V%）乙腈；流速，1.0 mL·min-1；进样量，20 μL；检测器波长，254 nm。

1.7 红外光谱分析和分子量测定

将纯多糖（1 mg）与KBr（100 mg）充分混合并用红外线干燥，然后用红外光谱扫描仪BIO-RAD FTS3000在4 000cm-1～400 cm-1的范围内扫描，扫描速率为1 cm-1。

通过凝胶渗透色谱柱HPSEC Shodex OH-park SB-805 测定多糖的分子量。色谱条件如下：柱温，30 ℃；注射量：20 μL；流速：0.8 mL·min-1；通过标准曲线计算多糖分子量。

1.8 甲基化分析

使用HAKOMORI[13]的方法并稍做修改，对多糖进行甲基化分析。将多糖（1.0 mg）与1.0 mL DMSO 溶解在烧瓶中，快速加入100 mg 无水氢化钠，并在室温下磁力搅拌0.5 h。然后缓慢加入0.5 mL 碘甲烷，在室温下磁力搅拌反应1.5 h，此过程在氮气保护下避光反应。最后，加入1 mL 水终止反应，用二氯甲烷从溶液中萃取甲基化多糖3 次。合并萃取液后，用水洗涤二氯甲烷层3 次，减压干燥二氯甲烷层，得到甲基化多糖。将甲基化多糖溶于0.5 mL 三氟乙酸（2 mol·L-1）中，并在安瓿瓶中于110 ℃密封水解4 h。待安瓿瓶冷却后，开口加入甲醇（1 mL），蒸发至干，重复多次除去三氟乙酸，将水解的样品并溶解在1 mL NaOH 溶液（0.05 mol·L-1）中，加入10 mg NaBH4，并在室温下反应4 h，然后加入2 滴冰醋酸中和直至无气泡产生，加入甲醇并蒸发至干多次以除去硼酸。将样品干燥并转移到EP 管中，加入0.5 mL 吡啶，将混合物在90 ℃水浴中密封0.5 h。冷却后，加入0.5 mL 乙酸酐，将混合物在100 ℃水浴中密封1 h。最后，将乙酰化样品在旋转蒸发器上蒸发至干，并溶于二氯甲烷（0.5 mL）中，并用水洗涤以除去不溶性盐和吡啶。将溶液通过0.45 μm 铝膜过滤，用于GC-MS 分析。

气相质谱联用仪条件：离子源温度，260 ℃；进样口温度，240 ℃；初始温度，60 ℃；程序升温，3 ℃·min-1，240 ℃保温10 min；色谱柱，DB-WAX（30 m×0.250 mm，0.50 μm，Agilent Technologies，USA）；检测器温度：250 ℃；氦气流速，1.5 mL·min-1；进样量，1.0 μL。

2 结果与分析

2.1 多糖的提取纯化

使用sevag 试剂进行脱蛋白操作，从200～400 nm 的扫描结果如图1A，在260 和280 nm 处没有特征吸收，表明没有蛋白质和核酸[14]。使用离子交换柱在水洗条件下洗脱出一个主要组分（图1B），通过SephadexG-100 凝胶渗透色谱进一步纯化显示其为单一组分（图1C）。纯化的多糖用于进一步的活性分析和结构表征。

图1 去蛋白后的F11 粗多糖紫外扫描曲线（200～400 nm）（A），F11 菌株胞外粗多糖经过DEAE-52 柱层析所得的洗脱曲线（B）；F11 菌株多糖过Sephadex G100 层析柱纯化的洗脱曲线（C）Fig.1 Ultraviolet scanning of F11 polysaccharide at the wavelength of 200 to 400 nm（A）;elution curve of crude polysaccharide on DEAE-52 column（B）,and elution curves of polysaccharide fraction（C）on Sephadex G-100 column.

2.2 多糖活性测定

图2A 显示了多糖纯品在去离子水系统中浓度从0.1 mg·L-1到1.0 mg·L-1的絮凝活性。实验结果表明，在剂量为0.5 mg·L-1时，最大絮凝率达到71.2%，在较少或较高剂量下絮凝活性逐渐降低。图2B 显示了多糖剂量范围为0.5～3.0 mg·L-1时，对于孔雀石绿的脱色效果变化曲线，在反应剂量1.8 mg·L-1时，达到最佳脱色效果92.4%。当剂量小于0.5 mg·L-1或超过3.0 mg·L-1时，脱色率显著下降。

图2 多糖剂量对絮凝率及脱色活性的影响Fig.2 The effect of F11 polysaccharide dosage on flocculation rate and decolorization activity

2.3 红外光谱分析

纯多糖的组成包括葡萄糖，甘露糖，葡糖胺，核糖和半乳糖。葡萄糖和甘露糖占主要比例，这意味着葡萄糖可能是微生物絮凝剂的基本骨架。核糖，葡糖胺和半乳糖可以是多糖的分支结构。

多糖的分子量确定为约31 kDa。如图3 所示，在400 和4 000 cm-1之间扫描纯化的多糖以分析FT-IR光谱。在3 432 cm-1处的强吸收峰证实了羟基的存在。1 393 cm-1和1 641 cm-1处的吸收峰是羧酸盐基团的C=O 不对称和对称伸缩振动的特征[15]。在1 111cm-1处观察到的强峰表明糖环的C-O-C 伸缩振动，也是糖衍生物的典型特征[16]。生物絮凝剂中羟基，羧基和羰基的存在可以改善生物絮凝剂中的结合能力。

图3 F11 菌株胞外多糖的红外光谱图Fig.3 The infrared spectrogram of F11 polysaccharide

2.4 多糖的单糖组成及分子量

反相HPLC 的结果（图4）表明多糖是一种杂多糖，其质量比由Man，GlcN，Rib，Gal 和Glc 组成，如表1所示。很明显葡萄糖是含量最多的单糖，甘露糖的比例小于葡萄糖，其余组分如GlcN，Rib，Gal 可忽略不计。在所有单糖组成中，中性糖（包括D-甘露糖，D-葡萄糖D-核糖和D-半乳糖）占多糖的总质量比例为97.8%，而氨基糖（GlcN）仅占2.2%，糖醛酸含量可以忽略不计。

表1 多糖的各单糖组成比例Tab.1 Monosaccharide composition of polysaccharide

图4 各单糖混合标准品液相色谱图（A），F11 菌株胞外多糖PMP 衍生物液相色谱图（B）Fig.4 HPLC chromatograms of PMP derivatives of standard monosaccharides（A）;hydrolyzed monosaccharides derivatives from F11polysaccharide（B）

2.5 甲基化分析

由于复杂的组成和特定的分子量，该多糖絮凝剂有着特殊的结构[17-18]。多糖是微生物分泌的胞外物质的主要成分，胞外多糖的研究有着重要的意义，然而，关于微生物胞外多糖絮凝剂分子结构研究很少，揭示絮凝机制与多糖分子结构的联系，仍然需要进一步的研究。

通过GC-MS 分析，获得质谱（图5）。与标准质谱相比，连接方式由葡萄糖1→2→3→4 连接，甘露糖1→2→3→4→6 连接组成。取代的羟基越多，分支越多。结合红外扫描，可以发现图4 中显示的羟基吸收峰较弱，C-O-C 成环骨架的吸收峰较强，与甲基化分析中的连接方式相吻合。

图5 F11 胞外多糖衍生物质谱图Fig.5 Mass spectrum of derivative extracellular polysaccharideof F11

2.6 多糖的絮凝机制

马尼拉贝黏附污泥可用作絮凝资源，从微生物中提取胞外多糖的研究很多[1,4,17,19-21]。胞外多糖是由微生物分泌的，因此絮凝活性的产生与粘性泥浆中的微生物群落有关。

广泛接受的絮凝机制主要包括压缩双电层、电性中和、架桥和网捕卷扫等假设[22-23]。然而，絮凝机制不仅是一种机制的功能，而是多种机制相互协同作用的结果。通过GC-MS 分析，糖苷键连接方式由葡萄糖1→2→3→4 连接，甘露糖1→2→3→4→6 连接组成。结合红外光谱中的较弱羟基峰，多糖具有多支链网络结构，多糖的多支链结构可促进其与悬浮颗粒的结合，实现沉降效果，这与网捕卷扫机制类似。

3 结论

在该研究中，从菌株F11 的发酵液中纯化出一种新型胞外多糖，可用作微生物絮凝剂，并通过GCMS，FT-IR，HPLC 分析方法表征胞外多糖。结果表明，微生物胞外多糖由72.6%葡萄糖和17.6%甘露糖组成。其分子量为31 kDa。高度支化的结构表明对絮凝和脱色有显著影响。在去离子水系统中，对高岭土的絮凝率达到71.3%，对孔雀石绿的脱色率为92.4%。较高的脱色率使其在未来水处理中有巨大的应用前景。絮凝过程有着复杂的机制，为了掌握分子结构和多糖性质之间的关系，需要进一步的深入研究。