中华绒螯蟹育苗传统亲本选择投放关键参数的科学性

宣富君，赵鑫月，付龙龙，鲍成满，管卫兵，唐伯平，潘建林，成永旭

（1.盐城师范学院湿地学院/江苏省盐土生物资源研究重点实验室，江苏盐城 224051；2.江苏省淡水水产研究所，江苏南京 210017；3.上海海洋大学海洋生态与环境学院，上海 201306；4.上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306）

中华绒螯蟹Eriocheir sinensis，俗称河蟹，是中国重要的经济水产物种。得益于20 世纪70 年代中华绒螯蟹人工育苗技术的突破[1]和土池育苗技术的推广应用[2]，目前中华绒螯蟹养殖已经遍布全国31 个省市自治区，包括台湾[3]和西藏[4]。中华绒螯蟹养殖产量从2000 年的23 万t 增加到2018 年的75 万t[5]，被称为特种水产养殖业的一朵奇葩，超过世界其他经济蟹类养殖和捕捞总和[6-7]。

种质退化是当下中华绒螯蟹产业健康发展所面临的重要课题之一。育苗单位曾盲目追求经济利益和降低生产成本，无序引进其他各大水系的苗种及采用小规格亲本用于苗种生产，造成商品蟹形状退化，规格小，养殖效益低下[8]。获取高质量的亲本是中华绒螯蟹育苗的关键[6]。一般认为亲本选用健康无残肢公蟹150 g，母蟹100 g 以上便是合理的，也就是传统苗种行业中所说的“公3 母2”。在实际生产过程中，无论采用何种规格，亲本投放性比一直沿用雌雄2～3：1 进行，即假设一只雄蟹可以和2～3 只母蟹成功交配，交配抱卵时间通常在20 d 左右（从亲本投放到群体内雌性整体抱卵后去除雄蟹）[9]。

然而，该中华绒螯蟹育苗传统亲本选择投放关键参数（“公3 母2”，投放性比2～3：1）的科学性至今无从考证。结合世界其他经济蟹类的研究成果揭示，比如著名的美洲蓝蟹Callinectes sapidus[10-12]和阿拉斯加雪蟹Chionoecetes opilio[13-14]，中华绒螯蟹育苗过程中这种人为的偏雌性的亲本选择投放模式存在精子限制的风险，即雌蟹因交配过程得不到充足的精子精液等雄性产物而出现抱卵不充分，流产等现象，严重的可能直接影响苗种的质量。笔者曾对江苏沿海苗场亲本交配前后个体的生殖状态进行调研，结果发现中华绒螯蟹存在性选择现象，少部分雄蟹由于参与过多交配活动甚至出现了“精尽蟹亡”的现象，——这些雄蟹输精管和副性腺整体干瘪发黄，管内甚至不存在一粒精荚[15]。因此，为了保证苗种质量和整个中华绒螯蟹产业的健康发展，对中华绒螯蟹亲本选择投放关键参数的科学考证显得尤为重要。

基于以上分析，本文拟参考国外经济蟹类围绕精子限制机制的研究成果，实验室条件下对中华绒螯蟹育苗传统亲本选择投放关键参数（即“公3 母2”亲本2～3：1 的雌雄配比）的科学性进行论证，以期揭示中华绒螯蟹的配子分配策略，加深对蟹类受精生物学的理解，预测传统育苗工作中采用该配比的合理性及可能出现的问题，尤其是当下普通产用大规格亲本苗种生产及遗传育种方面的工作提供理论和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用蟹于2019 年11 月20 日采购于江苏盐城大丰当地的养殖户。其中，公蟹60 只，规格145～155 g之间，母蟹100 只，95～105 g 之间，符合“公3 母2”的标准。亲本雌雄隔离，分别暂养于盐城师范学院江苏省盐土生物资源重点实验室，期间每天18：00 投喂1 次新鲜野杂鱼，投喂量为蟹总重的10%左右，次日上午08：00～09：00 清理残饵，每日换水1/3，确保水质清新，最后从中挑选十足健全、体质健壮的亲本进行分组实验。

1.2 实验方法

暂养10 d 后，实验按雌雄不同性比（♀：♂=1：1；♀：♂=3：1；♀：♂=5：1）在3 个面积为3 m2帆布池内进行。帆布池底部铺10 cm 细沙，水位控制在35 cm 以上，盐度25，底部充足供氧。投放密度为4 只·m-2（参考当地育苗单位）[15]，室内水温维持在6～13 ℃之间。鉴于室内温度比较稳定及尽量与育苗单位实际工作一致，每组实验持续时间设定为15 d，实验于2020 年1 月14 日结束，前后开展3 组，共经历45 d。

每组实验结束后，观察记录每只蟹的生殖状况并迅速解剖。雄蟹输精管和副性腺占雄蟹整个生殖系统的绝大部分[16]，取出输精管、副性腺，称重拍照后计算输精管指数（vaso-somatic index，VSI，含副性腺）。VSI不受螃蟹规格大小的影响，可以作为雄性生殖状况的潜在指标[15]。期间，选择每个性比组3 只有代表性个体置于10%中性甲醛中保存，进行后续组织学检测，AB-PAS 染色（作为对照，同时解剖20 只未交配个体，计算VSI）。雌蟹在记录每只蟹的抱卵流产情况后，取其纳精囊，并对含精液个体用镊子挤出所含精液称重，同时通过镜检，确定交配情况（同样，每组保留3 只有代表性个体用于组织学观察，AB-PAS 染色，如含精液精荚等雄性产物，表明个体存在交配活动）。解剖20 只未交配母蟹，解剖观察卵巢发育状况并计算卵巢指数（ovarian index，OI，一般认为母本交配季节卵巢指数达到10%以上，性腺发育成熟，可进行交配产卵活动）。

两性腺指数计算公式如下：

VSI=输精管（含副性腺）重量/体重×100%；

OI=卵巢重/体重×100%。

1.3 数据分析

采用SPSS 13.0 软件对实验数据进行统计分析。其中，文中各组均值差异运用标准差表示，而图中比较分析均值差异运用标准误表示；各组均值比较分析雄性VSI 和雌性纳精囊精液含量分别运用Bonferroni检测。此外，为进一步表明河蟹交配过程精液等雄性产物分配不均，不同性比数据汇总后建立散点图。

2 结果

雄蟹亲本交配前VSI 为3.45±0.57（n=20），雌蟹卵巢指数达到12.30±1.11（n=20），性腺发育良好。

交配后，绝大部分组内雄蟹的输精管（含副性腺）由于精荚精液等雄性产物的输出均出现不同程度的变化，管径减小，有的组个体输精管（含副性腺）颜色由乳白色转变为半透明或透明状（图1A），但管内仍含雄性产物精液精荚（如图1B,C）。相应的，输精管指数（VSI）与未交配个体相比，除雌雄性比1：1 1#略有上升（VSI=3.55，P＞0.05），整体随性比提高，呈下降趋势（图1D）。此外，根据Bonferroni 检测，即使在3：1 和5：1 条件下，各组VSI 也出现明显差异。例如：在性比3：1 组，1# VSI 值尽管低于未交配个体，但数值较高（VSI=2.44），与未交配个体差异不显著（P＞0.05），而与2#（VSI=1.35），3#（VSI=0.95）相比，下降明显（P＜0.05）；5：1 组，1#（VSI=2.51）交配后VSI 下降不显著（交配率仅为50%，P＞0.05），而与2#（VSI=1.06），3#（VSI=0.87）差异明显（交配率达到90%，P＜0.05）。

图1 不同生殖状态雄性输精管（包括副性腺）形态特征和各组输精管指数（VSI）变化Fig.1 Morphological characteristics of male vas deferens（including accessory gonads）in different reproductive states and changes of vas deferens index（VSI）in each group

交配后，纳精囊通常呈乳白色，内部充满精荚精液等雄性产物（图2A），但在性比5：1 条件下（2#，3#），部分个体纳精囊呈半透明或透明色，内含少许或不含精荚精液等雄性产物（图2B）。对不同性比交配未产卵个体纳精囊精液含量分析：即使同一性比同一组不同个体间，个体接收雄性精液的量存在明显差异（图2C）。例如：性比1：1 2#，纳精囊精液含量最高的可达3.20 g，而最低的仅为0.90 g，两者相差2.30 g；性比3：1，精液2.81 与0.48（3#），1.81 与0.36（2#）均来自同一组。抱卵后，纳精囊内剩余的精液量亦参差不齐（图2D）：随着性比提高，同一性比条件下差异收窄，整体呈下降趋势（Bonferroni 检测，P＜0.05）。其中，性比1：1，精液剩余含量处于0.31～2.30 g 之间（均值（1.06±0.65）g），3：1 处于0.20～2.14 g 之间（均值（0.60±0.53）g），而5：1 则聚集在0.18～0.64 g 之间（均值（0.38±0.13）g），近80%处于0.5 g 以下。对各组交配抱卵情况统计进一步发现，性比1：1 和3：1 组，均成功抱卵，未出现流产现象；5：1 组，尽管1#交配个体亦成功抱卵，但交配率仅50%；而2#，3#交配率达90%，但流产严重，高达83.3%和100%。以5：1 组中出现流产现象纳精囊无色精液含量为基准（0.64 g），1：1 组41.67%，3：1 组80%低于该值（图2D），但1：1 和3：1 组纳精内仍含有剩余精子/精荚等雄性产物。

图2 不同生殖状态雌性纳精囊形态特征和内含雄性产物变化Fig.2 Morphological characteristics and changes of male products in different reproductive states of female spermathecae

3 讨论

本文首次对中华绒螯蟹育苗传统亲本选择投放关键参数的科学性进行了检验，结果表明亲本“公3 母2”，选择投放雌雄性比2～3：1，该参数充分兼顾了中华绒螯蟹生殖的生物学特性，具有相当的精准性。在该体系下（本文代表雌雄性比为3：1），交配后和性比1：1 一样，纳精囊内始终存乳白色精液精荚等雄性产物，抱卵个体并没有出现诸如性比5：1 组中纳精囊中因缺乏精液精荚而流产现象。

交配后，雄蟹输精管和副性腺均出现了不同程度的变化，VSI 整体呈下降趋势，但不同性比即使同一性比条件下，各组均出现了明显的差异。比如：雌雄性比1：1 1#，3：1 1#，5：1 1# 条件下，VSI 与未交配个体相比，输精管与副性腺呈乳白色，均没有出现大的起伏，而其余各组雄蟹由于消耗较多，差异显著，尽管实验中雄蟹没有出现之前苗场调研报道的“精尽蟹亡”现象，即输精管干瘪发黄，一个精荚也没有[15]，但之前中华绒螯蟹雄性个体生殖潜力的研究表明，3 两以上个体具备连续交配3 次或多达6 次的能力，丧失交配能力前可以输送超过60%以上精荚精液等雄性产物[9]，本次实验中这些VSI 偏低个体明显参与了多次交配活动，导致其输精管变细，副性腺收缩，呈半透明色。中华绒螯蟹不像已经报道的美洲蓝蟹[10]、三疣梭子蟹Portunus trituberculatus[17]等软壳交配的物种，它属硬壳交配，交配前没有明显的交配前抱对现象，而且也不能提前释放信息素吸引对方[18]，交配活动要相遇后才发生，因此，中华绒螯蟹交配活动发生是随机的，这可能直接导致了性比5：1 组中出现未交配母蟹（尤其是1#，交配率仅为50%，也造成该组VSI 与未交配组没有差异）。此外，雌蟹没有产卵前可以多次与不同雄蟹发生交配（产卵后，停止交配，作者亲自观察），这也致使实验中（各个组别）出现了VSI 差异，例如：性比1：1 中1# VSI 与未交配个体相比不降反升，可能就是该组雌蟹交配不久就产卵了，结合雄蟹精荚精液等雄性产物具备一定的自我恢复能力（10 d 内可恢复交配前80%以上的储存量）[15]，这些都与中华绒螯蟹的繁殖习性有关。

纳精囊是雌蟹交配后存储精荚精液等雄性产物及排卵时精卵交汇的地方。但在实验中，不同性比条件下各组雌蟹纳精囊内雄性产物（无论是否抱卵）均出现了较大的偏差（例如：未产卵性比1：1 2#，性比3：1 3#和2#；产卵性比1：1 和3：1）。一则如上所述跟雌蟹的生殖状况有关，雌蟹没有抱卵前可以多次交配；二是在交配过程中雄蟹似乎对交配对象并没有十分严格的要求，随机交配[18]，而且之前的研究表明每次交配输送给雌蟹雄性产物的量比较均一[9]。因此，交配活动的多寡导致了中华绒螯蟹纳精囊雄性产物存量的差异。在对雌蟹产卵后纳精囊剩余存量进一步分析发现：随着性比提高，同一性比条件下差异收窄，整体呈下降趋势（从性比1：1 均值（1.06±0.65）g 到5：1 均值（0.38±0.13）g，这与已经报道的其他经济蟹类的精子分配策略一致，即精荚精液等雄性产物是宝贵的[19-20]，雄性为了利益最大化，尽可能把有限的资源分配到更多交配对象中，从而尽可能多的获得更多的后代[21]。

在雌雄性比1：1 和3：1 条件下，不论产卵与否，中华绒螯蟹雌蟹纳精囊呈乳白色，交配抱卵后没有出现流产现象，而5：1 组流产现象比较严重，流产个体纳精囊呈半透明或透明状，含无色液滴，不含或仅存少许解离的精荚或精子。以5：1 组中出现流产现象纳精囊精液含量为基准（0.64 g），1：1 组41.67%，3：1 组80%低于该值，但1：1 和3：1 组纳精内仍含有剩余精子/精荚等雄性产物。根据之前雄性个体生殖潜力研究表明[9]，交配过程雄性交配过程中输送给雌蟹的精子全部用于第一次受精抱卵，潜在精卵比可达（1.59～10.86）×103，高于堵南山[22]观察到的受精过程每枚卵附着数百个精子及可以保证蓝蟹[11]和雪蟹[13]正常受精的25～70：1精卵比，这与苗场调研结果一致[9,15]，也解释了当下苗场一直沿用传统亲本选择投放参数而没有报道类似国外经济蟹类管理中精子限制的原因。至于实验中流产个体纳精囊中出现一定量的无色透明液体，它的来源及功能作用有待进一步研究。

综上，本文的结论充分说明了中华绒螯蟹育苗传统亲本选择投放关键参数的科学性，尽管无从考证，该参数应该是老一辈科学家和育苗单位多年实践的智慧结晶。目前，为了解决种质问题，规避小规格亲本带来的弊端，越来越多的科研单位和育苗场认识到大规格亲本育苗的重要性[23-24]。在以江苏省淡水水产研究所为代表的多家科研单位的推动下，河蟹育苗单位纷纷采用大规格亲本，根据盐城市农村农业局统计2019 年光盐城射阳地区采用4 两以上的大规格亲本就占60%，近41 万只。那么在中华绒螯蟹亲本规格日益提高的条件下，传统的育苗模式是否适合，是否存在进一步优化的可能，对科技工作者提出了新的要求。