乳及乳制品中抗生素残留检测研究进展

王雪晴,郝爱月,谭新柳,张立慧,梅艳珍,戴传超,明灯明,黄 菲,杨雅琼

(1.南京工业大学 药学院,江苏 南京 211800;2.南京师范大学 生命科学学院,江苏 南京 210046;3.南京师范大学 食品与制药工程学院,江苏 南京 210046)

牛奶因其营养丰富,易于消化,便于食用,而成为人类理想的天然食品。常喝牛奶有助于身体的发育,补足钙质需求量,减少骨骼萎缩,降低骨质疏松症的发生概率。然而,随着乳及乳制品行业的快速发展,抗生素被大量应用于畜牧业中,其根本目的是为了保障动物的健康以及畜牧业的经济效益,但也不可避免地造成了乳制品中抗生素的残留[1]。乳与乳制品中抗生素的种类主要包括:四环素类、β-内酰胺类以及氨基糖苷类等,因其可以有效预防和治疗人类和动物的传染病,而在人类医学和畜牧业中受到极大关注,被广泛用作食品添加剂以及治疗畜牧业中的细菌感染性疾病。牛奶中的抗生素残留是全世界奶牛业普遍存在的问题,这是因为奶牛场均用抗生素类药物治疗奶牛疾病,如奶牛的乳腺炎、子宫内膜炎或其他炎症性疾病。据调查,在我国临床型奶牛乳腺炎发病率占牛乳腺炎总发病率的21%～23%[2]。

奶牛在饲养过程中会经常性地感染大量有害病菌。例如:乳牛食入了被农药或放射性物质污染的饲料和水。而饲养牛奶的农户为促进牛体正常生长并且要治疗疾病,就会通过注射或者饲喂等方式对乳牛使用一些激素和抗生素。这些激素、抗生素、放射性物质和农药就会通过牛机体而进入牛乳中,对牛乳造成污染。除此之外,为了保证新鲜获取的牛乳不被细菌污染,也会在牛乳中加入抗生素来抗菌,这些都是牛乳中可能存在抗生素残留的原因。Vieira等[3]的实验证明：即使牛乳中含有微量的抗生素,也可导致人体对抗生素产生过敏或增加抗药性,因此对大众健康有害,同时影响发酵乳制品的生产。为此,了解乳与乳制品抗生素残留的来源、类别以及危害,实现乳与乳制品中抗生素残留检测成为当前食品安全检测的当务之急。

1 乳及乳制品中残留的抗生素

几十年来,抗生素药物特别是四环素类、β-内酰胺类和氨基糖苷类抗生素是乳与乳制品中抗生素残留的主要类别[4]。

四环素类药物属于一个抗生素大家族,它的首批成员来自放线菌的链霉菌属。1944年从金色链霉菌中分离出金霉素,几年后,分别从龟裂链霉菌和金霉素链霉菌中分离出土霉素和地美环素,金霉素氢解后生成四环素[5]。20世纪60年代初,人们开发出了多西环素,它是土霉素的半合成衍生物[5]，2005年又合成出替加环素。这一类广谱抗生素,能抑制蛋白质合成,使药物可逆地与敏感菌的核糖体30S亚基结合,阻碍氨基酰tRNA与mRNA-核糖体复合体上的受体结合,阻止氨基酸增加到肽链上[6]，且对四环素类呈抑菌活性,但是对敏感菌具有杀灭作用[6]。

β-内酰胺类抗生素包括青霉素族和头孢菌素族,这类药物都具有杀菌活性,主要通过干扰细菌繁殖过程中肽聚糖的合成来发挥效果[7]。β-内酰胺类抗生素主要通过共价键与细菌细胞壁上的青霉素结合成蛋白(PBP),PBP是一种胞壁粘肽合成酶, 可以使肽聚糖分子的N-乙酰胞壁酸-N-乙酰葡糖胺骨干上肽链之间交叉连接。当抗生素与PBP结合后,细菌细胞壁合成因缺乏交叉连接,细胞壁形成受阻,从而导致生长细胞裂解[8]。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌对β-内酰胺类的敏感性差异是由于后者细胞壁上肽聚糖的含量较高,二者含有青霉素结合蛋白的量不同,使得某些β-内酰胺类很难渗透穿过革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖层[9]。

氨基糖苷类抗生素分为天然和半合成两大类,天然来源的包括由链霉菌属培养液中提取获得的链霉素、卡那霉素和新霉素等；人工半合成的主要有阿米卡星、奈替米星等[10-11]。氨基糖苷类是浓度依赖型抗菌药物,对需氧革兰氏阴性菌和某些革兰氏阳性菌有杀菌活性,但对厌氧菌几乎没有杀菌活性[10-11]。不同的氨基糖苷类药物作用稍有区别。链霉素及其二氢衍生物作用于核糖体上的单一位点,但其他氨基糖苷类则作用于多个位点上[12-13]。氨基糖苷类具有杀菌作用,有剂量依赖性,而且有显著的抗生素后效应。虽然从理论上讲,β-内酰胺类通过药物干扰细胞壁的合成,从而促进氨基糖苷类药物渗透进入细菌细胞。然而,有一些动物用的制剂类型,例如：氨基糖苷类和普鲁卡因青霉素盐通过合并使用，确实可以增强杀菌的活性[14]。同时,细菌对氨基糖苷类药物的耐药性是通过介导细菌酶实现的,这些细菌酶可以灭活氨基糖苷类并阻止其与核糖体结合。编码这些酶的基因位于质粒上,这样便于将耐药性迅速转移到其他细菌中[15-17]。

2 乳及乳制品中抗生素残留的危害

抗生素的危害从它对细菌的作用机制来分析,主要有:阻碍细菌的细胞壁合成,致使细胞壁缺损死亡[18];抑制细菌细胞生存所必需的蛋白质合成[19]。首先,随着各种抗生素在我国畜牧业中的不断使用,一些与乳制品相关的细菌很容易产生耐药性,甚至会产生交叉耐药性,还会通过畜禽产品传染给人体,使抗生素作用大大降低,甚至无效,并导致严重的公共卫生问题[20]。其次，长期食用含有抗生素的乳品,会破坏微生态平衡、抑制肠道菌群的正常生长,并产生耐药性的致病菌,致使某些维生素(如维生素B族、维生素K)缺乏,机体免疫力下降[20]。最后,经常食用含有抗生素的乳品还会导致敏感人群产生过敏症状,甚至会导致过敏性休克,其主要症状为胸闷、呼吸困难、面色苍白、脉细弱、血压下降、大小便失禁、昏迷和意志丧失等,严重者可在短时间内死亡[20]。除此之外,抗生素残留还有可能促使动物体产生基因突变、畸形和导致癌症的发生等危害[21]。

3 乳及乳制品中抗生素的检测

2001年,我国农业部发布实施了《无公害食品生鲜牛乳行业标准》[22],对新鲜牛乳的卫生指标明确了“不得抗生素检出”的要求。但目前我国尚未能严格执行此行业标准,致使我国乳及乳制品中抗生素残留问题一直未能得到解决,引起了人们对牛奶安全问题的担忧[23]。

赵杰等[24]在2013年采用氯化三苯基四氮唑法(TTC法)对贵阳地区60份牛奶样品进行检测,结果显示：抗生素残留显示阳性结果1份。安先霞等[25]使用TTC法对永靖县部分奶牛养殖场随机抽取40份生鲜乳样品进行检测,结果显示：3份样品呈抗生素残留阳性,2份样品为可疑样品。Wang等[26]利用基于受体的化学发光酶联免疫吸附试验即TetR蛋白与四环素(TC)的特异性结合，检测50个牛奶样品中的四环素残留(图1(a)),结果显示：3个样品被确定为阳性；并且以TC计算的残留水平发现:样品A质量浓度为15 ng/mL;样品B质量浓度为18 ng/mL;样品C质量浓度为46 ng/mL。为了进一步确认,使用高效液相色谱法(HPLC法)进一步测定这些牛奶样品[24],结果显示:3种样品都含有TC残留物,其中样品A中的TC质量浓度为18 ng/mL;样品B中土霉素(OTC)质量浓度为25 ng/L;样品C中的TC质量浓度为41 ng/mL)。其HPLC色谱图见图1(b),由此说明,我国乳制品残留情况仍然存在。

图1 (a)TetR蛋白的三维构象与(b)TC的分子对接复合物及3种阳性乳样品的HPLC色谱图[26]Fig.1 Three-dimensional conformation of TetR protein and molecular docking complex with TC (a) and HPLC chromatogram of three positive milk samples(b)[26]

4 乳及乳制品中抗生素残留检测方法

随着食品安全问题越来越受到重视,食品安全检测技术也在近些年来迅速发展,已经有许多便捷快速且灵敏度高的方法应用于乳及乳制品的抗生素残留检测中,主要有：微生物检测法、理化检测法、免疫分析法等。

4.1 微生物检测法

微生物检测法的测定原理是根据抗生素对微生物生理机能、代谢的抑制作用来定性确定样品中抗微生物药物的残留,可以用作筛选技术,预先筛选可能存在的抗生素残留物[27]。但是其结果误差大,测定时间长,而且如果仅使用微生物检测法来鉴定,也很可能出现不可测量的假阳性或假阴性结果。微生物检测法主要有氯化三苯基四氮唑法(TTC)、戴尔沃试剂盒法和琼脂扩散法等[28]。

4.1.1 氯化三苯基四氮唑法(TTC)

TTC法的原理是基于抗生素对微生物的抑制作用,最初是由Berridge[29]发明,将嗜热链球菌培养基和酸碱颜色指示剂溴甲酚紫添加到牛奶样品中,在孵育样品期间,每30 min测定一次颜色,指示剂变色的时间可作为衡量抗菌药物在牛奶中残留浓度的一个指标。Galesloot等[30]利用嗜热链球菌和亚甲基蓝作为指示剂,进一步优化了酸碱指示剂,发现牛奶中青霉素G残留检测的灵敏度可以达到1 μg/L。

Hyun等[31]采用TTC法对奶牛场常用的5种磺胺类抗生素和2种喹诺酮类抗生素进行检测,其结果为磺胺喹恶啉、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺甲氧嘧啶最低检测质量浓度均为25 μg/L,磺胺二甲嘧啶和磺胺甲嘧啶最低检测质量浓度均为50 μg/L,而两种喹诺酮类抗生素由于含量极低，并没有通过TTC法检测出来。Eftychia等[32]用微生物抑制法，快速检测牛乳中的10种抗生素,其中青霉素的最低检测限为4 μg/L,符合国家检测标准要求。陈芳[33]将TTC法与MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)两种分析方法进行对比,用于牛奶中青霉素和链霉素残留检测。发现两种方法结果一致,不加青霉素或链霉素的阴性试管内的乳液变成红色,加不同浓度的青霉素或链霉素的阳性试管内的乳液未变色,结果见图2。由图2(a)可知：加青霉素的阳性试管和不加青霉素的阴性试管,从左到右的浓度分别为加青霉素0、0.004、0.04、0.4和4 IU/mL;图2(b)为加链霉素的阳性试管和不加链霉素的阴性试管,从左到右的浓度分别为加链霉素0、0.004、0.04、0.4和4 IU/mL。

图2 (a)TTC法检测青霉素和(b)链霉素的试验结果[33]Fig.2 Test results of penicillin test by TTC method (a) and test results of streptomycin test by TTC method (b)[33]

4.1.2 戴尔沃试剂盒法(Delvo-X-PRESS)

Delvo-X-PRESS(DSM Food Specialties)是一种基于酶的快速检测方法,是为检测奶罐和奶仓中β-内酰胺类残留而专门设计的,只需几分钟就可以检测出结果[34]。Delvo-X-PRESS是一种基于受体-酶的竞争性、定性检测方法[34]。受体蛋白来源于嗜热脂肪芽孢杆菌,能够特异性识别出多种β-内酰胺类,BCP(溴甲酚紫)用于指示反应信号,根据颜色反应(特异性生成黄色)可以判断是否含有β-内酰胺类残留,检测结果通过肉眼或者自动化的读数系统进行判断,整个检测耗时在10 min以内[34]。

崔晨光[34]采用戴尔沃试剂盒法对三元纯牛奶和奶罐生鲜乳样本中青霉素G和磺胺嘧啶两种抗生素进行检测后发现：三元纯牛奶作为对照样品检测结果为阴性,奶罐生鲜乳检测结果为阴性,说明随机抽取的奶罐生鲜乳是合格的。青霉素G浓度在1 μg/L时,采用戴尔沃牛奶广谱抗生素检测试剂盒即可检出,而其对磺胺类药物也很敏感,在20 μg/L时即可检出,结果见图3。

图3 (a)青霉素G检测结果和(b)磺胺嘧啶检测结果[34]Fig.3 Penicillin G test results(a) and sulfadiazine test results (b)[34]

4.1.3 琼脂扩散法

琼脂扩散方法(agar diffusion method)的原理是通过测定琼脂平皿上标准受试微生物抑菌圈的大小,是一种目前应用最为广泛的筛选技术[35-36]。孵育过程中,液体样品会扩散到琼脂培养基的基质中。孵育一段时间后(在8～36 h之间,确切时间取决于具体试验),测量抑菌圈的大小。如果存在的抗菌浓度超过一定的限度,微生物生长会被抑制(微生物死亡/生长受抑制),在琼脂平皿上可见清晰的抑菌圈,详见图4。该方法是检测牛乳中抗生素残留最传统的方法[37-38]。

图4 琼脂扩散法[36]Fig.4 Agar diffusion method[36]

4.2 理化检测法

4.2.1 反相液相色谱法

抗菌药物分析最常用的是反相液相色谱(RPLC),RPLC固定相(3.5 或5.0 μm颗粒)由非极性或疏水性有机填料(如辛基、十八烷基、苯基或氰基基团)通过硅氧烷(甲硅烷基醚)键(—Si—O—Si—)附着在硅基载体的表面而形成[39]。化学键合十八烷基硅烷(ODS、C18)或18个碳原子的烷烃是最常用的固定相;较短烷基链键合的色谱柱如C8、苯基或氰丙基键合相的非极性较小,偶尔可作为替代;反相填料的表面是疏水性的,其保留机制是疏水性、分配和吸附作用[40]。大多数抗菌药物在反相色谱柱上的保留和分离情况良好,但氨基糖苷类化合物和林可霉素除外,需要使用离子对试剂或亲水作用色谱(HILIC)来分析[41]。RPLC流动相由乙腈或甲醇、水和修饰剂组成。RPLC的保留程度和选择性很大程度上取决于流动相的性质和组成、pH调节剂和流动相的离子强度[42]。

Han等[43]利用HPLC技术检测了牛奶中36种抗生素的残留情况,结果表明：以3和10倍信噪比(S/N)确定各化合物的检出限(LOD)和定量限(LOQ),分别为0.01～5 和0.03～10 μg/kg。所有分析物的LOQ远低于中国和欧盟规定的标准,适用于牛奶中抗生素残留的痕量分析。

4.2.2 高效液相-质谱联用技术

液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)是液相色谱与质谱联用的仪器。液相色谱流动相的组成以及缓冲液或添加剂的浓度和pH,对抗菌药物的最佳电离效率、离子喷射稳定性和色谱分离至关重要。如何选择合适的溶剂取决于需要分析的化合物的性质、采取的电离方法和所用的色谱柱[44-46]。LC-MS流动相最合适的溶剂是水、甲醇和乙腈。甲醇比乙腈柱后压高。LC梯度洗脱过程中,柱后压随着流动相的黏性变化而呈比例变化。甲醇和水混合液比纯甲醇或纯水黏性大,40%甲醇水的黏性达到最大,为1.62 mPa/s[44]。然而,乙腈和水混合时,当乙腈比例增加时,黏度下降。在一些条件下,如反相液相-大气压化学离子源色谱(LC-APCI)或液相大气压光电离子源(LC-APPI),以及分析一些质子亲和力相对较低的分析物时,最好用甲醇来提高离子化效率,因为甲醇的质子亲和力(PA)低于乙腈。例如：采用LC/APCI-MS(液相色谱-大气压化学离子源-质谱联用)分析质子亲和力较低的甾体类化合物时,甲醇优于乙腈[45]。

Wang等[46]利用高效液相-质谱联用技术检测了牛奶中6种抗生素(红霉素、青霉素G、盐酸四环素、磺胺甲恶唑、盐酸环丙沙星和青霉素V)的残留情况,结果表明：6种目标化合物在10～200 μg/L范围内呈良好的线性关系,R2为0.995～0.999。以3和10倍信噪比(S/N)确定各化合物的检出限(LOD)和定量限(LOQ),分别为0.4～3和0.1～0.5 μg/kg。

4.3 免疫分析法

免疫分析是指检测抗体与抗原性分析物之间的特异性反应的方法[47]。现代免疫分析方法起源于Hummel等[18]使用抗胰岛素抗体测定人血浆中激素含量的研究工作[48]。免疫分析依据检测的是初级抗原抗体反应或是二级反应,分为直接法和间接法两种。免疫分析方法具有检测限低、特异性高、操作简单、分析时间短和易于自动化等优点。目前,已经报道了多种免疫分析方法,它们各具优缺点。已报道的用于兽药残留检测的免疫分析方法很多,操作方法简单的有侧流层析法(Later-flow devices, LFDs)和试纸条法、酶联免疫吸附试验(ELISA)和放射性免疫分析法(RIA)等,操作复杂且需要精密仪器的免疫分析方法有基于表面等离子体共振(SRP)的光学生物传感器法[49]。

4.3.1 酶联免疫吸附试验(ELISA)

目前,酶联免疫吸附试验(ELISA)是最常见的一种免疫测定法。20世纪70年代，Engvall等[50]最早建立了ELISA技术[50]。首先将抗原或抗体包被在固相材料表面,加入样品反应后,再通过适当方法分离结合和未结合组分,使得ELISA可用于检测复杂样品中的待测物,许多现代的生物分析方法大多是基于传统的ELISA方法建立的(图5)[51]。

图5 酶联免疫吸附实验原理[51]Fig.5 Enzyme linked immunosorbent assay schematic[51]

传统的ELISA通常使用显色指示剂和底物,获得可观测的颜色变化,大多数文献报道的ELISA方法或商品化的抗菌药物残留检测试剂盒均基于显色指示剂[52-53]。最新的ELISA技术已开始通过荧光、电化学发光和实时聚合酶链反应等来进行定量检测。这些非酶类的指示信号具有多种优势,如：灵敏度更高、多残留检测能力,微阵列检测。现在这些技术已被成功应用于食品中抗菌药物的检测[54-55]。虽然许多报道的ELISA方法既可使用多克隆抗体，也可使用单克隆抗体作为捕获识别分子,但由于杂交瘤细胞可源源不断地产生均一性的单克隆抗体,因此目前基于单抗的ELISA方法呈现增长的趋势。2005年,Samsonova等[56]采用竞争ELISA法检测牛奶中青霉素的残留,检测线性质量浓度范围为2～32 ng/mL。

4.3.2 表面等离子体共振(SPR)生物传感器技术

生物传感器(Biosensor)是由生物辨识元件(BRE)和电化学转换器构成的,是一种可将分析物的浓度转化为电信号的装置。最早的生物传感器是一种催化体系,这个体系整合了生物受体(即酶、细胞器或微生物)和转换器,可将生物反应转化为电子信号[57]。当生物相互作用发生时,其他物化参数也随之发生改变,包括焓、离子电导率和质量。根据这个效应,可以将生物催化作用和转换器结合起来投入应用[58]。光学、电化学、感温、压电和电磁传导都是常用的传导机制。

SPR与大多数免疫化学分析技术相比,具有不需要酶标记或荧光标记目标物或识别元件的优点。SPR已经与微流控技术相结合,可实现结合复合物的连续、实时监控[59]。SPR可提供目标分子的浓度、结合特异性、亲和力、动力学和协同效应等信息。

4.4 常见抗生素残留检测方法的优缺点

微生物检测法、理化检测法和免疫分析法是目前应用于乳及乳制品中抗生素残留检测的3种主要检测方法,其各有优缺点(见表1)。微生物检测法是根据抗生素对微生物生理机能、代谢的抑制作用来定性或定量确定样品中抗微生物药物残留,检测费用较低,但是测定时间长、特异性差、灵敏度低以及结果误差大[27]。理化检测法是一种根据抗生素的分子理化性质对其进行分离和检测的方法,这种方法分析速度快、灵敏度高、结果稳定以及准确可靠,但是样品前处理复杂、仪器昂贵和需专业操作人员操作[60-61]。免疫分析法是以抗原与抗体特异性结合为基础的分析技术,其操作简单、取样量少和检测快速,但由于其检测面较窄、特异性抗原抗体价格较高等特点,导致免疫分析法的推广和普及还需要很长的时间。

表1 常见抗生素残留检测方法的优缺点

5 结语

乳及乳制品中抗生素残留问题是涉及人类健康的公共卫生问题,目前我国为了解决这个问题已经在不断完善乳及乳制品中抗生素残留的限定标准,科研工作者也一直在寻求简便、快速、准确和灵敏度高的检测方法,使得乳及乳制品中抗生素残留检测技术的研究得到了很好的发展。微生物检测法由于其检测时间长、灵敏度差以及易产生误差而很少被应用于抗生素残留的检测。理化检测是实验室常用的操作方法,其高效灵敏、应用范围广,但常须要专门的人员进行操作,因此不适用于乳品企业的在线监测。免疫分析与生物传感器的结合是近几年研究的热点,例如免疫胶体金层析技术,既可达到高特异性、高灵敏度的要求,而且还有效地实现可视化检测,有效地避免了仪器分析中须要专业人员操作的问题,能很好满足乳品企业的需求。但这种方法存在后滞现象,样品使用前须进行稀释处理,而且易出现假阴性或假阳性信号。目前很多商业化的试剂盒可以用于乳与乳制品中抗生素检测,但由于价格昂贵,大批量测试花费巨大。随着技术的发展,实现更加简单快捷、灵敏高效、多组分抗生素同步分析的检测是未来发展的趋势。笔者建议应该继续重视乳及乳制品中抗生素残留的检测技术的开发与改进,来满足日趋严格的残留限量检测要求,实现检测过程的智能化、自动化。