急性胰腺炎大鼠caspase-1依赖性腺泡细胞焦亡的观察

邱婷，占凌辉，陆程翔

厦门大学附属中山医院神经内科1、重症医学科2，福建 厦门 361004

细胞焦亡是一种新近研究发现的细胞死亡方式。它以伴随着大量炎症因子的释放为特征，能够诱发强烈的炎症反应。在多种炎症性疾病中已显示出与炎症反应的持续加重及不良预后有关[1-3]。既往认为，在急性胰腺炎中通常存在大量的细胞凋亡现象。近年来的研究显示，这些被检测出的凋亡细胞事实上有相当一部分其实是焦亡的细胞[4]。但是细胞焦亡在急性胰腺炎中的具体情况目前仍不清楚。本研究旨在探讨caspase-1依赖性腺泡细胞焦亡在急性胰腺炎中的具体情况，为临床治疗急性胰腺炎提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 动物选择与分组 健康成年Wistar大鼠12只，体质量160～180 g。采用随机数表法将其分为对照组和胰腺炎组，每组6只。

1.2 模型制备及处理 实验前大鼠禁食12 h，自由饮水。胰腺炎组大鼠分2次腹腔内注射20%L-精氨酸溶液(2×100 mg/100 g)，间隔1 h。对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水(1.0 mL×2)。

1.3 光镜苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)观察胰腺组织病理学变化 造模成功后24 h，两组大鼠采血后处死，经腹腔分离切取胰腺组织块，常规石蜡包埋。将石蜡包埋的胰腺组织切片，行HE染色，在光镜下观察胰腺组织学改变。

1.4 蛋白免疫印迹(Western blot)检测腺泡细胞caspase-1、GSDMD表达情况 胰腺组织块以裂解液进行裂解。用BCA法测定蛋白质含量。之后稀释样本至2μg/μL。取40μg样品行SDS-PAGE电泳。用湿转法将凝胶上蛋白样品转印到PVDF膜上并加入兔一抗封闭过夜(GSDMD：Abcam公司；caspase-1：碧云天)。次日5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，羊抗兔ΙgG(H+L)HRP(GSDMD：abcam公司；caspase-1：碧云天)反应。实验中以β-actin(Abcam公司)作为内参照。继以ECL反应后显影、定影。用Quantity One软件进行定量测定(v4.62版本)。结果以待测蛋白与内参照β-肌动蛋白(β-actin)的灰度值比值表示。

1.5 血清标本采集与处理 各组于模型制作成功后24 h经尾静脉采集静脉血，室温下，离心并取上清液于-70℃保存。以ELΙSA测定血清白介素-1β(ΙL-1β)、白介素-18(ΙL-18)水平。

1.6 统计学方法 应用SPSS19.0软件分析数据。所有计量资料以均数±标准差(±s)表示，均数间比较采用t检验，相关分析采用Person相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠胰腺组织的病理学改变 胰腺炎组大鼠的胰腺肉眼大体观可见：胰腺组织明显水肿，颜色暗红，未见到明显的出血及坏死表现。镜下病理变化较轻微，主要是以间质水肿、空泡形成以及炎性浸润为主。对照组则无明显病理改变，见图1。

图1 胰腺组织的病理学改变(×200)

2.2 两组大鼠腺泡细胞活化caspase-1、GSDMD表达水平比较 与对照组比较，胰腺炎组的活化caspase-1及GSDMD表达水平明显增高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

组别对照组胰腺炎组t值P值例数6 6 caspase-1 0.20±0.02 0.59±0.04 19.221＜0.05 GSDMD 0.23±0.02 0.58±0.08 9.947＜0.05

2.3 两组大鼠的血清ΙL-1β、ΙL-18水平比较 胰腺炎组大鼠血清ΙL-1β和ΙL-18明显高于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 两组大鼠血清IL-1β、IL-18比较(±s，pg/mL)

表2 两组大鼠血清IL-1β、IL-18比较(±s，pg/mL)

组别对照组胰腺炎组t值P值例数6 6 ΙL-1β 24.34±4.52 115.14±13.12 16.028＜0.05 ΙL-18 21.67±3.98 185.91±14.72 26.375＜0.05

2.4 caspase-1与血清ΙL-1β、ΙL-18水平的相关性 应用Pearson相关分析法检验胰腺组织活化caspase-1与血清ΙL-1β、ΙL-18水平的相关性，结果显示，胰腺组织活化caspase-1与血清ΙL-1β、ΙL-18水平均有显著的正相关性(相关系数分别为0.979和0.974，P＜0.01)。

3 讨论

急性胰腺炎作为一种常见的急重症，其病情凶险多变，它的发生发展及转归一直是临床医学研究的重点之一。急性胰腺炎发病机制上，通过胰酶的激活、大量的细胞因子和氧自由的产生造成腺泡细胞的损伤,这些受到损伤的腺泡细胞进一步在多种炎症介质的作用下发生胞膜破裂以及更多的炎症因子释放，最终形成放大式的炎症反应加重。通常胰腺腺泡细胞的损伤可以出现凋亡、自噬、焦亡和坏死等多种死亡结局。细胞焦亡是较新发现的一种受调控的程序性的细胞死亡方式[5]。细胞焦亡发生时，有较多的微小孔隙在细胞膜上形成并导致细胞膜的受损,进而使得细胞膜两侧的离子梯度消失，炎性物质从胞内释放到胞外，细胞间液流入胞内，最终细胞出现肿胀破裂。与这一过程同时发生的还有细胞核的浓缩以及随机降解和断裂的染色体DNA。与凋亡的不同之处在于焦亡细胞虽然也有发生核固缩，但其细胞核能够保持完整，而不发生核裂解[6-7]。

随着对焦亡的研究深入，已有诸多线索提示腺泡细胞焦亡在急性胰腺炎中可能发挥重要的作用。比如，通过新的检测手段能区分出在急性胰腺炎中用TUNEL法检测出来的凋亡细胞中是混有杂有许多焦亡细胞的；在胰腺炎的标本中明确检测出活化caspase-1阳性表达；在caspase-1基因缺乏大鼠制作的急性胰腺炎中观察到明显的降低的炎症的程度[8-9]；在用雨蛙素腹腔注射制作的大鼠急性胰腺炎模型中观察到ΙL-1β前体的mRNA水平出现明显的增高[10]；急性胰腺炎患者血清中ΙL-1水平也明显高于正常人群[11-12]。研究普遍认为凋亡减轻炎症反应而焦亡促进炎症反应,对疾病的转归影响截然不同。但是，目前对于细胞焦亡在急性胰腺炎中的具体情况尚不明确。

新近的研究结果表明焦亡所依赖的caspase-1在急性胰腺炎炎症反应过程中发挥的作用不容忽视。焦亡过程中ΙL-1β前体需要在caspase-1的作用下方能转化为有活性的ΙL-1β进而释放至胞外发挥作用。诱导caspase-1基因表达或者caspase-1基因缺乏均可以影响急性胰腺炎大鼠的炎症程度[8-9]。近年来对于GSDMD的深入研究认为Pro-caspase-1有切割GSDMD的作用。Caspase-1前体在被激活之后能够对GSDMD进行切割，终致启动细胞焦亡[13-14]。GSDMD作为caspase-1的作用底物，在被其切割后形成的氮端肽段是发生细胞焦亡的关键步骤。敲除GSDMD基因能够使细胞焦亡受到阻断，细胞最终发生凋亡。基于GSDMD在焦亡中的这一重要地位，目前普遍认为，能否验证GSDMD的活化是证实细胞发生焦亡的重要依据之一。在本研究中，活化caspase-1指标明显增高，并且GSGDM也出现明显增高，这些结果反映了在急性胰腺炎中存在明显的caspase-1依赖性细胞焦亡现象。并且这种焦亡形式在急性胰腺炎的炎症发展中起着某种重要的作用。

目前已知，经典焦亡途径是caspase-1介导的需炎症小体参与的通路。各种损伤信号经过传导而作用于炎性小体，使得caspase-1活化，终致细胞膜上形成孔洞，同时ΙL-1β和ΙL-18前体也被活化并释放出细胞，能够造成炎性细胞的黏附、聚集，放大组织炎症反应，这是细胞焦亡发生的主要机制[15-16]。其具体的过程，目前认为是炎性小体通过其所包含的接头蛋白ASC以CARD-CARD和PYD-PYD相互作用结合的形式，把caspase-1和炎性小体以类似桥梁的形式衔接在一起，这样caspase-1前体被活化，并且可以作用于ΙL-1β和ΙL-18前体使其得以激活[17-18]。这样在细胞焦亡的同时，出现了瀑布式的炎症反应。已有学者的研究证实，在急性胰腺炎早期阶段ΙL-1β及ΙL-18就出现明显的升高，并且在整个病情进展过程中始终保持着较高的水平[19]。在研究中，可以发现血清ΙL-β和ΙL-18表达出现显著增高，并且相关性证实caspase-1的活化与血清ΙL-β和ΙL-18的增高之间呈显著正相关性。这更增加了caspase-1依赖性细胞焦亡存在的证据。因此，也有理由相信，综合caspase-1、GSDMD和ΙL-1β和ΙL-18的显著活化情况可能是反映腺泡细胞焦亡程度的一个预测指标，对于判断急性胰腺炎的预后有重要的意义。

本研究未就细胞焦亡的病理表现进行深入的研究，其与caspase-1依赖的GSDMD活化的相关性尚不清楚。这一途径是否还存在其他形式的激活通路，能否通过抑制这一焦亡途径来实现抑制胰腺炎的发生及发展？这些还需要进一步的研究探讨。