基于指纹图谱和化学计量学的浓香型白酒分类研究

钱 宇，胡 雪，孙 跃，李锦松，黄志久，李 丹，张怀山，康峰豪，林 莉

（1.泸州老窖集团有限责任公司，四川 泸州 646000；2.四川轻化工大学 化学工程学院，四川 自贡 643000；3.四川大学 化工学院，四川 成都 610000；4.四川轻化工大学生物工程学院，四川 自贡 643000；5.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡 643000）

中国白酒是以粮谷为主要原料，用大曲、小曲或麸曲及酒母等为糖化发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏而制成的，是世界六大蒸馏酒之一，具有悠久的历史，在国内外都享有盛誉[1]。白酒中的风味成分含量极低，仅占总质量的1%～2%[2]。目前，白酒中已知的风味化合物超过1 000种[3-4]。其中，超过60余种是白酒中的关键风味成分[5-6]，决定了白酒的香型、风格和品质。然而，由于地域、酿造工艺、原料、储存环境等条件的不同，不同品牌的白酒在风味成分的种类和含量上存在差异。以往主要是依靠于品酒师的感官分析来对这些白酒进行区分，这种方式不仅需要长期积累经验，而且受人的情绪、身体条件等影响较大，不能保证结果的准确性和稳定性。随着经济的增长，白酒受到越来越多消费者的喜爱，一些不法商贩假冒注册商标，以次充好，欺骗消费者。为保证消费者和生产厂家的合法权益，对不同品牌的白酒进行鉴定变得十分重要。

目前，气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技术已经被广泛地应用于茶叶[7]、蜂蜜[8-9]、食醋[10]、化妆品[11]等领域，主要对其香气成分进行定性定量分析。同时，在白酒风味化合物的定性定量分析和白酒分类鉴别中[12-14]，GC-MS更是有巨大的潜力，这使得白酒质量、品牌、香型的鉴别结果更加准确[15-17]。然而，随着检测技术的发展，白酒中越来越多的化合物被检测出来，通过化合物种类之间的差异对白酒进行区分的可能性不大，只有找出决定酒类差异的关键风味成分进行分析，并且结合不同品牌的白酒风味成分的差异和模式识别的方法对其进行区分才具有积极意义[18]。近年来，模式识别的优点日益突出，已有许多研究学者将模式识别的方法用于茶叶[19]、酒类[20-22]等领域的研究，并且取得了一定成果。在各种分类鉴定的研究中，大多数学者选取的分类鉴定指标较多，这样虽然能尽可能的将样品间的差异包含进去，但也使实验过程变得复杂[23-25]。

本研究以GC-MS技术快速测定的浓香型白酒风味成分为指标，结合相似度分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）和判别分析（discriminant analysis，DA）对7个品牌共33个样本进行区分鉴别，以期为更多白酒产品的区分鉴别提供新的方法，为不同品牌的浓香型白酒区分标准的建立提供理论依据和有效方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选择7个品牌共33个浓香型白酒样品为研究对象，每个品牌的白酒涵盖了从中低端到高端不等价位，样品信息见表1，所有酒样均购于京东官方自营店。

表1 本研究所用浓香型白酒样品信息Table 1 Information of strong-flavor Baijiu samples used in the study

C7～C40正构烷烃（均为色谱纯）：北京曼哈格生物科技有限公司；无水乙醇（纯度99.5%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇（纯度99.9%）：上海阿达玛斯试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TSQ8000三重四极杆气相色谱-质谱联用仪、AI1310多功能自动进样器：美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 气相色谱条件优化

为了获得最佳的分离效果，同时节省分析时间，对气相色谱条件进样口温度（220 ℃、230 ℃、250 ℃）、初始温度（40 ℃、50℃、60 ℃）、40 ℃时的保留时间（0min、1 min、3 min）、40～120 ℃的升温梯度（10 ℃/min、20 ℃/min、30 ℃/min）、120 ℃时的保留时间（0 min、3 min、5 min）、120～290 ℃的升温梯度（10 ℃/min、20 ℃/min、30 ℃/min）、290 ℃时的保留时间（0 min、3 min、5 min）、分流比（40∶1、50∶1、60∶1）进行优化，所有试验的进样量均为1 μL，色谱柱为HP-5毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。

质谱条件：电离方式电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；传输线温度为250 ℃；扫描方式为全扫描；扫描质量范围为质核比（m/z）=30～550。

定性：将C7～C40的正构烷烃标准品和酒样进行GC-MS分析，利用质谱数据库美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）12进行检索，计算的保留指数（retention index，RI）与文献报道的保留指数进行对比综合定性，其中保留指数的计算公示如下：

式中：RIx表示待测组分的保留指数；T（i）表示待测组分的保留时间，min；n和n+1分别表示正构烷烃的碳原子个数，个；T（n）和T（n+1）分别表示待测组分出峰前后相邻的两个正构烷烃的保留时间，min。

1.3.2 浓香型白酒中挥发性风味成分的检测

采用1.3.1优化后的GC-MS条件检测浓香型白酒样品中的挥发性风味成分。

1.3.3 数据处理数据统计采用MicrosoftExcel，数据分析采用ChemPattern化学计量学软件。

2 结果与分析

2.1 气相色谱条件优化结果

通过1.3.1优选出最佳的色谱条件：进样口温度250 ℃，升温程序：初始温度40 ℃，保留1 min，以10 ℃/min升高至120 ℃，再以20 ℃/min升高至290 ℃，保留5 min，分流比为50∶1。

2.2 浓香型白酒中挥发性风味物质的分析

以最优的气相色谱-质谱条件对浓香型白酒样品WLY-1中的挥发性风味成分进行检测分析，其风味成分的总离子流色谱图见图1。

图1 浓香型白酒样品WLY-1中挥发性风味成分GC-MS分析总离子流色谱图Fig.1 Total ion flow chromatography of volatile flavor components in strong-flavor Baijiu sample WLY-1 analysis by GC-MS

由图1可知，在15 min内能快速检出112种风味成分，且以己酸乙酯为主，乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙缩醛、乙酸等为骨干成分。

2.3 方法学验证

2.3.1 仪器精密度实验

取同一批次浓香型白酒样品1份，按照最优的GC-MS条件连续测定5次，分别对化合物峰面积和相对保留时间进行统计。结果表明，总离子流色谱图中各化合物的色谱峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）＜2%，相对保留时间的RSD＜0.5%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 方法重复性实验

取同一批次浓香型白酒样品6份，按照最优的GC-MS条件进行测定，分别对化合物峰面积和相对保留时间进行统计。结果表明，总离子流色谱图中各化合物色谱峰相对峰面积的RSD＜5%，相对保留时间的RSD＜0.1%，表明该实验方法的重现性良好。

2.3.3 样品溶液稳定性实验

取同一批次浓香型白酒样品1份，分别在0、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样，按照最优的GC-MS条件进行测定，分别对化合物的峰面积和相对保留时间进行测定，其中化合物峰面积的RSD＜3.5%，相对保留时间的RSD＜0.15%，表明酒样在24 h内保持稳定。

2.4 不同品牌浓香型白酒的指纹图谱

本研究选取7个品牌共计33个浓香型白酒样品，按照最优的GC-MS条件对酒样进行检测，记录下33个浓香型白酒样品的总离子流色谱图，见图2。由图2可知，同一品牌的酒样中含量较高的风味成分差异不大，不同品牌酒样中含量较高的化合物间的差异较明显，如酒样中含量较高的风味物质为乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯和己酸乙酯，在酒样WLY中乳酸乙酯、戊酸乙酯和己酸乙酯含量明显高于其他品牌。除此之外，一些含量稍低的风味成分在不同品牌的酒样间也存在一定的差异。因此，利用浓香型白酒中的挥发性风味成分的总离子流色谱图进行分类具有一定的可行性。

图2 33个浓香型白酒样品中挥发性风味成分GC-MS分析总离子流色谱图Fig.2 Total ion flow chromatography of volatile flavor components in 33 strong-flavor Baijiu samples analysis by GC-MS

2.5 指纹图谱共有模式的建立和相似度评价

将33个酒样的GC-MS总离子流色谱图导入ChemPattern软件中，以色谱峰面积归一化后相对峰面积＞0.5%为限定值挑选用于相似度分析的风味化合物，筛选结果见表2。由表2可知，共筛选得到31种共有化合物，酯类14种，醇类8种，醛酮类6种，酸类2种，烷烃类1种。利用夹角余弦算法计算样品间的相似程度。相似度分析结果显示，酒样相似度在0.65～0.95之间，表明同为浓香型白酒，不同品牌间样品的骨架风味成分存在显著差异。同时根据相似度聚类结果来看，相同品牌不同等级的酒样骨架风味成分具有很高的相似性。

表2 33个浓香型白酒样品中的共有化合物信息Table 2 Information of common compounds in 33 strong-flavor Baijiu samples

2.6 主成分分析

基于共有化合物的峰强度对所有样品进行主成分分析，相关矩阵的特征值见表3。由表3可知，第一主成分（principal component 1，PC1）的方差贡献率为57.74%，第二主成分（PC2）的方差贡献率为18.44%，第三主成分（PC3）的方差贡献率为13.53%，前三个主成分累计方差贡献率达到89.71%，基本保留了酒样原来变量的信息。因此，取前三个主成分作为该研究的主要成分进行不同品牌浓香型白酒的区分是可行的。

表3 33个浓香型白酒的主成分分析特征值和总体方差描述Table 3 Principal component analysis characteristics and total variance description of 33 strong-flavor Baijiu samples

以PC1、PC2、PC3为坐标轴建立每个浓香型白酒样本的三维得分图，见图3。由图3可知，7个不同品牌的浓香型白酒的区分度较高，其中五粮液（WLY）、今世缘（JSY）、迎驾贡酒（YJGJ）、水井坊（SJF）、丰谷（FG）、泸州老窖（LZLJ）的酒样都能进行有效地分离。由于诗仙太白（SXTB）的酒样分布较分散，与泸州老窖的酒存在部分的交叉，因此，区分效果较其他品牌稍差。

图3 33个浓香型白酒主成分分析得分图Fig.3 Score of principal component analysis of 33 strong-flavor Baijiu samples

2.7 判别分析

经过判别分析，取得了5个典型判别函数，其特征值分别为95.46、5.67、4.69、1.18、0.19，分别能够解释模型方差变化的89.01%、5.28%、4.43%、1.12%、0.16%。其中前两个典型判别分析函数可解释94.29%的方差变化，包含了样品的主要信息，可以描述7个不同品牌的浓香型白酒中风味成分的差异与联系。用前两个典型判别函数对各个酒样做散点图，结果见图4。由图4可知，迎驾贡酒（YJGJ）、水井坊（SJF）和丰谷（FG）这三个品牌酒样的组质心距离相对较近，较为相似，但都相互分离，没有重叠，其余4个品牌的组质心距离较远，说明他们差异较大。总的来说，7个品牌的组质心都相互分离，没有出现重叠的现象。这个结果与主成分分析的结果基本一致，表明了对于不同品牌浓香型白酒的分类，主成分分析和判别分析都是很有效的工具，对于不同品牌的浓香型白酒的分类和预测具有一定的指导意义。

图4 典型判别分析散点图Fig.4 Scatter plots of canonical discriminant analysis

对7个品牌的33个浓香型白酒样品进行判别分析。分别从各个品牌中随机抽出一个样本作为“测试样本”，共计7个，以剩下的26个样本为“训练样本”建立判别函数，然后对测试样本进行判别，确定其品牌，并与样本实际品牌对比。在本次研究中，获得7个典型变量，依据这些变量建立一个判别函数来实现不同品牌的浓香型白酒的分类，准确的区分率为100.0%，鉴定分类结果见表4。

表4 浓香型白酒典型判别分析预测结果Table 4 Prediction results of canonical discriminant analysis of strong-flavor Baijiu samples

由表4可知，浓香型白酒的GC-MS分析总离子流色谱图结合判别分析可用于不同品牌的浓香型白酒的鉴别模型的建立，7个样品的鉴别正确率为100.0%。结果表明，指纹图谱可用于不同品牌的浓香型白酒的区分。

3 结论

本研究采用气相色谱-质谱联用仪对7个品牌的33个浓香型白酒样品进行了指纹图谱分析，并结合多种化学计量学方法进行鉴定。结果表明，相似度分析中，酒样的相似度区在0.65～0.95，说明不同品牌酒样中的风味成分基本相同，但在含量上具有一定的差异；主成分分析中前3个主成分累计方差贡献率为89.71%，三维主成分散点图表明其对不同白酒的区分较好，具有一定的可行性。判别分析中前两个主成分能够解释模型的94.29%方差变化，分类结果表明对不同品牌的判定结果的正确率为100%，前2个判别函数的二维散点图显示区分效果显著，极大地提高了分类正确率，准确率高达100%；可见，气相色谱-质谱联用仪结合多种化学计量学的方法可用于不同品牌浓香型白酒的区分。