芒果苹果复合果酒发酵工艺优化及成分含量测定

尚远宏，田金凤

（攀枝花学院 生物与化学工程学院，四川 攀枝花 617000）

芒果（Mangifera indicaLinn.），漆树科芒果属的多年生植物[1]，芒果果实为热带跃变型果实[2]，其营养丰富[3]，果肉含糖量为9.5%～20.9%，总酸量为0.1%～0.64%[3-4]，其中芒果苷在不同品种、不同成熟度的果肉中的含量不尽相同[5]，但为芒果的主要活性成分，具有抑菌、抗炎、抑制中枢神经系统等作用。目前，攀枝花的凯特芒果种植最多，占芒果种植总面积接近70%[6]，产量约为20多万t，但由于芒果具有明显的季节性特征[7]和不易保藏，以及果农盲目跟种而导致种植面积扩大，又无规模化的芒果加工，出现了鲜果供过于求的现象，影响种植户增收[8]。苹果（Malus domesticaBorkh.）属于蔷薇科苹果亚科的苹果属，是栽培种类的统称[9]，其富含维生素C（vitamin，VC）、多酚、膳食纤维、可溶性糖、果胶、类黄酮类化合物、有机酸、矿物质和微量元素等[10-11]。目前，金冠苹果种植面积是盐源县苹果种植总面积接近60%以上[12]，产量近30万t，成熟期过于集中，冷链贮运、果品产后处理和市场培育严重滞后，加工专用型品种处于空白，制约了苹果产业效益的发挥和提高[12-13]。

芒果发酵酒[14-17]和苹果发酵酒[18-19]的研究报道众多，但是芒果苹果复合果酒的研发却鲜有报道。攀枝花芒果和盐源苹果资源丰富，营养价值较高，酸甜适口，香气浓郁，适合用作原料加工成果酒，既可以延长货架期，又可以提高经济价值。因此，本研究以凯特芒果和金冠苹果作为原料，研制芒果苹果复合果酒，采用单因素及响应面法优化其发酵工艺，并测定复合果酒中的芒果苷含量，使果酒工艺可行可控，为果酒实际生产奠定了实验基础，芒果和苹果复合果酒的研制，对解决攀枝花芒果和盐源苹果的销售问题提供了思路，有较好的发展前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

果胶酶（酶活10 000 U/g）、纤维素酶（酶活10 000 U/g）：山东西亚化学工业有限公司；柠檬酸（分析纯）：潍坊英轩实业有限公司；芒果苷标准品（纯度＞98%）：中国食品药品检定研究院；安琪专用葡萄酒酵母：安琪酵母股份有限公司；攀枝花凯特芒果、盐源金冠苹果、白砂糖：市售；甲醇（色谱级）、偏重亚硫酸钾（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent1260高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）：美国安捷伦公司；BDV-325414167电子天平：捷久计量衡器（上海）有限公司；A115038糖度计：上海邦西仪器科技有限公司；PHS-550数显酸度计：杭州陆恒生物科技有限公司；ZTS-1P烘箱：昆山台顺测试科技有限公司；0.1分度酒精计：武强县精创仪器仪表厂；LRH-250-2振荡培养箱：广东省医疗器械厂；KH5200E超声波清洗器：昆山禾创超声仪器有限公司；PHX智能生化恒温培养箱：宁波莱福科技有限公司；ZDHW数显恒温水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芒果苹果复合果酒的工艺流程及操作要点

操作要点：筛选成熟度好的苹果和芒果，清洗，沥干，待用。芒果去皮去核后榨汁，加入纤维素酶（0.4 g/L）和果胶酶（4 g/L），40 ℃酶解90 min，90 ℃灭酶3 min[8]，冷却至室温，过滤后得到芒果原汁。去核后的苹果榨汁，添加果胶酶（5 g/L）和纤维素酶（0.3 g/L），40 ℃酶解90 min，90 ℃灭酶3 min，冷却至室温，过滤后得到苹果原汁。量取200 mL混合果汁（芒果汁与苹果汁体积比为75∶25）和水50 mL，用适量白砂糖调整初始糖度为18%，柠檬酸调整pH值为3.7，偏重亚硫酸钾加入量为50 mg/L，其可以起到杀菌和提高稳定性[20]。在无菌条件下，混合果汁以活化后的0.10%酵母菌接种（安琪酵母水溶液置于35 ℃的恒温水浴活化60 min，待观察其产气泡丰富时，即可作为活化菌种使用），并在27 ℃恒温培养箱中发酵10 d后，虹吸上层酒液保存于无菌容器中，并冷藏静置1 d，过滤，巴氏杀菌（65 ℃、30 min）[21]，即得芒果苹果复合果酒。

1.3.2 芒果苹果复合果酒发酵工艺优化

单因素试验：选取芒果汁和苹果汁的体积比分别为（10∶90、25∶75、50∶50、75∶25、90∶10）、安琪酵母添加量分别为（0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）、发酵温度分别为（23 ℃、25 ℃、27 ℃、29 ℃、31 ℃）、初始糖度分别为（14%、16%、18%、20%、22%）、初始pH值分别为（3.1、3.3、3.5、3.7、3.9）进行单因素发酵试验，以酒精度及感官评分为评价指标，确定各因素对芒果苹果复合果酒品质的影响。

响应面试验：在单因素试验的基础上，选择混合果汁初始pH值为3.7、活化酵母添加量为0.10%和发酵时间为10 d，利用Box-Behnken试验设计对芒果汁和苹果汁体积比（A）、初始糖度（B）及发酵温度（C）3个主要因素进行优化，以酒精度（Y1）和感官评分（Y2）为响应值进行响应面试验。试验因素及水平见表1。

表1 发酵条件优化Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation process optimization

1.3.4 感官评分

参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行感官评分[22]，选10名食品专业人员，分别对芒果苹果果酒产品的色泽、香气、澄清度、滋味、典型性进行感官评分，满分100分，具体感官评分标准参照文献[23]。

1.3.5 理化指标检测方法

酒精度：参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中的酒精计法测定[24]；糖度：糖度计测定；酸度：酸度仪测定；总糖（以葡萄糖计）：直接滴定法测定[22]。

1.3.6 高效液相色谱法测定果酒中芒果苷含量

高效液相色谱条件：Agilent C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸（28∶72，V/V）[25]，流速为1 mL/min，检测波长为258 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL。

对照品溶液制备：精密称取17.40 mg的芒果苷标准品，置于25 mL容量瓶中，加入体积分数为40%甲醇至刻度，摇匀，即得0.696 mg/mL芒果苷对照品溶液。按照上述色谱条件，测定峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，芒果苷质量浓度（X）为横坐标绘制芒果苷标准曲线。

取500 mL发酵完成的果酒，在80 ℃以内加热浓缩至50 mL，取浓缩后25 mL的果酒置于100 mL容量瓶中，加入体积分数为40%甲醇至刻度，超声30 min，微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取滤液作供试品溶液。按照上述色谱条件，测定峰面积，计算样品中芒果苷含量。

1.3.7 数据处理

试验所得数据为重复3次试验的平均值，采用Origin 7.5作图和Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 发酵工艺优化单因素试验

2.2.1 酵母添加量对复合果酒品质的影响

由图1可知，随着酵母接种量的增加，酒精度和感官评分先升高后下降，且在接种量为0.10%时，芒果苹果复合果酒酒精度和感官评分均为最大值，分别为（11.7±0.2）%vol和（84.5±0.4）分，但再继续增加酵母接种量，出现果浆中糖分过多而促进了酵母菌的生长繁殖，反而不利于发酵，酒精度随之下降，且不利于酒精和香气物质的形成，口感变差。因此，选择0.10%作为酵母最适添加量。

图1 酵母添加量对芒果苹果复合果酒感官评分和酒精度的影响Fig.1 Effect of yeast inoculum on sensory score and alcohol content of mango and apple compound wine

2.1.2 初始糖度对复合果酒品质的影响

由图2可知，当初始糖度为14%～16%时，由于糖度不足，使芒果苹果酒中酒精度较低，发酵果酒风味不佳，感官评分较低；当初始糖度达到18%时，酒样感官评分（最高）为（83.6±0.5）分，酒精度为（11.1±0.1）%vol，果酒风味较好，说明该糖度比较适宜果酒发酵；在初始糖度＞18%时，糖度过高，果酒黏度增加，影响感官评价。因此，选择18%作为最适初始糖度。

图2 初始糖度对芒果苹果复合果酒酒精度和感官评分的影响Fig.2 Effect of initial sugar content on sensory score and alcohol content of mango and apple compound wine

2.1.3 发酵温度对复合果酒品质的影响

由图3可知，感官评分和酒精度随发酵温度的升高先升高后降低，同时在温度为27 ℃时达到最大值，分别为（84.1±0.4）分和（11.6±0.2）%vol，而后随发酵温度升高，酵母衰老加速（活性受到抑制）使酒精度下降，影响口感，导致感官评分下降。因此，选择27 ℃作为最适发酵温度。

图3 发酵温度对芒果苹果复合果酒酒精度和感官评分的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory score and alcohol content of mango and apple compound wine

2.1.4 芒果汁和苹果汁体积比对复合果酒品质的影响

由图4可知，不同芒果汁和苹果汁体积比（10∶90、25∶75、50∶50、75∶25、90∶10）条件下，芒果苹果复合果酒酒精度在11.5%vol～11.7%vol范围内基本不变。当芒果汁和苹果汁体积比为10：90时，芒果苹果复合果酒感官评分较低，为（73.8±0.3）分，口感风味较差。当芒果汁和苹果汁体积比为75∶25时，发酵生产的复合果酒感官评分最高，为（84.1±0.3）分，酒精度适宜，为（11.6±0.1）%vol；而随着芒果汁和苹果汁体积比继续升高时，复合果酒感官评分降低。因此，选择芒果汁和苹果汁最适体积比为75∶25。

图4 芒果汁和苹果汁体积比对芒果苹果复合果酒酒精度和感官评分的影响Fig.4 Effect of volume ratio of mango juice and apple juice on sensory score and alcohol content of mango and apple compound wine

2.1.5 初始pH值对复合果酒品质的影响

由图5可知，随着初始pH值的增大，酒精度和感官评分均先升高后下降，当pH值为3.1～3.5时，果酒酒精度较低，感官评分低，口感风味较差，说明pH值过低导致酵母的生长受到了抑制，发酵速度慢，不利于果酒风味物质的形成。在pH值为3.7时，芒果苹果复合果酒酒精度和感官评分均达到最大值，分别为（11.4±0.2）%vol和（83.9±0.3）分，说明此pH值下发酵的果酒风味较好。当pH值为3.9时，酒精度和感官评分均降低，说明pH值过高，可能出现杂菌生长较快，影响酵母的正常生长代谢和口感评价。因此，选择最适初始pH值为3.7。

图5 初始pH值对芒果苹果复合果酒酒精度和感官评分的影响Fig.5 Effect of initial pH value on sensory score and alcohol content of mango and apple compound wine

2.2 发酵工艺优化响应面试验

在单因素试验的基础上，固定混合果汁初始pH值为3.7、活化酵母添加量为0.10%和发酵时间为10 d，以芒果汁和苹果汁体积比（A）、初始糖度（B）及发酵温度（C）为主要影响因素，以酒精度（Y1）和感官评分（Y2）为响应值进行响应面试验。响应面试验方案及结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 发酵工艺优化Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation process optimization

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用分析软件Design-Expert 8.0.6对表2试验数据进行多元回归方程拟合，得酒精度（Y1）和感官评分（Y2）二次多项回归模型方程为：

由表3可知，采用响应曲面法优化建立的芒果苹果发酵工艺回归方程（模型），其2个模型均极显著（P＜0.01），且失拟项均不显著（P＞0.05），且酒精度校正系数R2adj为97.59%和感官评分的校正决定系数R2adj为99.62%，表明模型是可靠的且拟合程度较好。以酒精度为响应值时，一次项A、C，交互项AC和二次项A2、B2、C2影响极显著（P＜0.01），且F检验可得因子贡献率为C＞A＞B；以感官评分为响应值时，一次项B、C影响显著（P＞0.05），一次项A和二次项A2、B2、C2影响极显著（P＜0.01），且F检验可得因子贡献率为A＞C＞B。各因素对结果影响的响应面及等高线见图6。由图6可知，在Y1模型中BC、AB交互作用不显著（P＞0.05），AC显著（P＜0.05）；而Y2模型中AC、BC、AB交互作用均不显著（P＞0.05），各因素对酒精度和感官评分的影响不显著，应用该模型时可以不考虑因素间的交互作用。但应用响应面寻优分析方法对回归模型进行分析时，选择酒精度和感官评分的重要性均为5，分别选择酒精度和感官评分的最大响应值，可得最优响应面分析结果∶芒果汁和苹果汁体积比74.02∶25.98，初始糖度为17.92%，发酵温度为27.34 ℃，并由此条件下发酵后芒果苹果复合果酒酒精度理论值为11.13%vol，感官评分理论值为84.1分。考虑实际的操作情况，将发酵工艺参数调整为芒果汁和苹果汁体积比为74∶26，初始糖度为18%，发酵温度为27 ℃，在此优化条件下进行3次验证试验，芒果苹果复合果酒的感官评分实际值为84分，酒精度实际值为11%vol，结果与预测值相差微小，说明回归模型可靠，用响应面优化芒果苹果复合果酒的发酵工艺可行。

图6 初始糖度、芒果汁和苹果汁体积比及发酵温度交互作用对芒果苹果复合果酒感官评分和酒精度影响的响应面及等高线Fig.6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between initial sugar,volume ratio of mango juice and apple juice and fermentation temperature on sensory score and alcohol content of mango and apple compound wine

2.3 复合果酒中芒果苷含量的测定

以峰面积（Y）为纵坐标，芒果苷质量浓度（X）为横坐标绘制芒果苷标准曲线，芒果苷对照品及样品HPLC检测结果见图7。

图7 芒果苷标准曲线（a）,对照品（b）及样品（c）高效液相色谱分析Fig.7 Standard curve (a),standard (b) and the sample (c) of mangiferin analysis by HPLC

由图7a可知，标准曲线回归方程为Y=2 937.1X+575.8，相关系数R2=0.999 4，芒果苷对照品在0.696～3.480 mg/mL范围内与峰面积的线性关系良好。由图7b和7c可知，最佳优化发酵工艺条件得到复合果酒样品中芒果苷含量为0.103 6 mg/mL。

3 结论

以攀枝花凯特芒果和盐源金冠苹果为原料，通过单因素试验，结合响应面分析法优化芒果苹果复合果酒酿造工艺参数，得到最佳发酵工艺参数为芒果汁和苹果汁体积比为74∶26，初始糖度为18%，发酵温度为27 ℃。在此发酵工艺条件下，得到芒果苹果复合果酒的感官评分为84分，酒精度为11%vol，果酒中芒果苷平均含量为0.103 6 mg/mL，其芒果苹果复合酒呈棕黄色，酒体澄清透明，酒香浓郁，口感柔和。本研究得到的芒果苹果复合果酒发酵工艺条件，可为今后水果果酒生产化提供一定参考意义。