miR-101、miR-122在妊娠期糖尿病患者血清和胎盘组织中表达及意义

陈丽霞，张秀薇，禤文婷，尹镇钊，陈松锦 （广东省东莞市人民医院内分泌科，广东东莞 523000）

妊娠期糖尿病（GDM）是妊娠期较为常见的并发症，其指妊娠起始或妊娠过程中出现葡萄糖耐量受损。目前对于GDM 发病机制尚不十分明确，既往相关研究指出孕产妇高雌激素水平与其胰岛素抵抗有关，认为胰岛素抵抗是GDM 重要的病理机制[1]。近年来，随着GDM发生机制的研究进展，越来越多的研究证实多种miRNA 直接或间接参与GDM 的生物学行为机制进程，其中miR‑101 可在转录后调节多种基因的表达，与糖脂代谢异常、炎症反应等密切相关[2]；而miR‑122 也被证实其参与了胰岛素分泌、糖酵解、脂肪细胞分化等生物学过程的调控[3]。因此，笔者认为两者可能与GDM的发生与进展、胰岛素抵抗、炎症反应、胎盘滋养层细胞的迁移与侵袭等具有一定关联。因此，本研究通过分析GDM 患者血清及胎盘中miR‑101 和miR‑122 的表达水平情况，分析其与胰岛素抵抗的相关性，以明确miR‑101与miR‑122在GDM预测、治疗及预后中的作用及意义。

1 资料和方法

1.1 病例与分组

选取2018年7月至2019年12月在东莞人民医院建档产检并分娩的GDM 孕妇42 例为观察组。纳入标准：(1)符合GDM 诊断标准，即行口服葡萄糖耐量试验显示：空腹血糖≥5.1 mmol/L；1 h血糖≥10.0 mmol/L；2 h 血糖≥8.5 mmol/L，满足任意一项即可诊断为GDM；(2)妊娠>16周；(3)在本院规律产检。排除标准：(1)既往无糖尿病或糖尿病家族史；(2)妊娠期高血压、高血脂、心脏病等其他妊娠合并症；(3)双胎妊娠；(4)全身感染性疾病。本研究已通过本院医学伦理委员会批准，患者及家属知情且签署同意书。并随机选取同期健康孕妇30例作为对照组。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 所有孕产妇均于清晨空腹时采集静脉血取血清，−20 ℃冰箱中待检。胎盘组织获取于胎儿与胎盘娩出后，生理盐水洗净，取胎盘中央母体面脐带根部组织5 mm×5 mm×5 mm 大小2～4 块组织物，约重120 mg，静置−80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 RNA 提取 采用RNAeasy extraction Kit 试剂提取血清RNA，用Trizol 试剂提取胎盘组织中RNA，同时采用Nanodrop 2 000 紫外可见分光光度计进行两样本中RNA 浓度及纯度检测。所有步骤均按试剂盒说明操作。

1.2.3 miRNA 逆转录 采用miRNA 逆转录及特异性检测试剂盒，引物采用miR‑101 特异性RT‑PCR 引物（Forward:5'‑CATCTTACCGGACAGTGCTGGA‑3'，下游为通用引物）检测miR‑101 的表达。采用miR‑122特异性引物（Forward：5'‑TGGAGTGTGACAATG‑GTGTTTG‑3’，下游为通用引物）miR‑122的表达。

1.2.4 荧光实时定量PCR 试剂盒使用TaKaRa 公司，反应参数：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，共40 个循环。熔解曲线检测从65 ℃开始，每0.5 ℃检测1 次。miRNA 表达量以2‑ΔCt 表示，其中ΔCt=CtmiRNA–CtU6。

1.3 观察指标

(1)临床参数指标：年龄，身体质量指数（BMI）。(2)胰岛素抵抗相关指标：取血清，采用全自动电化学发光分析仪空腹血糖（FPG）及空腹胰岛素（FINS），胰岛功能采用稳态模型计算HOMA 胰岛素抵抗指数（HOMA‑IR）=（FPG×FINS）/22.5，HOMA 胰岛素分泌指数（HOMA‑IS）=（20×FINS）/FPG‑3.5。(3)两组血清及胎盘中miR‑101与miR‑122表达水平差异。

1.4 统计学处理

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以表示，采用t检验；采用Pearson 相关性分析血清miR‑101与miR‑122水平与临床参数和胰岛素抵抗相关指标的相关性。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床参数和胰岛素相关指标

观察组孕产妇BMI、FBG、FINS、HOMA‑IS 及HOMA‑IR 指标均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05 或0.01），见表1。

表1 两组临床参数和胰岛素相关指标比较 ()

表1 两组临床参数和胰岛素相关指标比较 ()

与对照组比较：aP<0.05，bP<0.01

2.2 miR‑101 和miR‑122 在两组血清和胎盘组织中表达水平

miR‑101和miR‑122在观察组血清和胎盘组织中表达水平均明显高于对照组（P<0.01），见表2 和图1、2。

图1 miR‑101的qPCR扩增曲线图

表2 miR‑101和miR‑122在两组血清和胎盘组织中表达水平比较 ()

表2 miR‑101和miR‑122在两组血清和胎盘组织中表达水平比较 ()

与对照组比较：aP<0.01

2.3 各项指标与血清miR‑101 及miR‑122 水平的相关性分析

血清miR‑101 水平与FBG 呈正相关，与FINS、HOMA‑IS 呈负相关（P<0.05）；miR‑122 水平与FBG、HOMA‑IR 呈正相关，与FINS 呈负相关（P<0.05），见表3。

表3 各项指标与血清miR‑101及miR‑122水平的相关性分析

3 讨论

当前，随着孕妇饮食结构及生活方式的改变，GDM 发病率呈逐年上升趋势。GDM 易造成较多种不良妊娠结局，对母婴均有严重危害，甚至长远影响，早期诊断并及时治疗可提高孕妇及胎儿的预后[4]。因此，新的生物学标记物在早期诊断GDM 尤为重要。miRNA 是一类进化过程高度保守的、广泛参与多种疾病的发生与进展的小分子非编码RNA，其在代谢调控和细胞功能中起到“动态调节器”的作用[5]。而近年来miRNA与GDM 的相关研究较为新颖，同时也为本研究提供了理论支持。

图2 miR‑122的qPCR扩增曲线图

本研究结果显示，miR‑101及miR‑122水平在GDM 患者血清及胎盘组织中均呈高表达，提示两者可能直接或间接参与了GDM的发生和发展。有多项研究证实，miR‑101 可通过调控EZH2/H3K27me3 通路参与调控多种疾病的进展，其中在胚胎横纹肌肉瘤、肺癌、膀胱移行细胞癌中，其通过降低EZH2/H3K27me3 表达，从而抑制细胞增殖来影响肿瘤进展[6‑8]。胎盘形成的前提是胎盘滋养细胞对母体子宫内膜的侵入及黏附，而miR‑101 在此过程中可能通过调控EZH2/H3K27me3 通路来影响胎盘滋养细胞的功能，导致胎盘滋养细胞迁移及增殖能力降低，参与GDM 发病[9]。而针对miR‑122 而言，其是前体基因位于18q21.31位点，参与了糖酵解、脂肪细胞分化、胰岛素分泌等代谢相关的生物学过程调控[10‑11]。在胰岛素抵抗细胞模型中，miR‑122 呈高度表达，而通过转染miR‑122 模拟物，AMPK 基因表述水平下调，进而加重胰岛素抵抗程度[12]。另外，胰岛素抵抗水平是胰岛细胞功能的一个重要指标，本研究在GDM 产妇胰岛素抵抗相关指标均比正常产妇的明显增高，且在相关性分析中，GDM 产妇血清miR‑101 水平与FBG 呈正相关，与FINS、HOMA‑IS 呈负相关；miR‑122 水平与HOMA‑IR、FBG 呈正相关，与FINS 呈负相关。说明GDM 产妇在胰岛素分泌状态下，产妇血清miR‑101表达显著下调；而产妇呈胰岛素抵抗状态时，其血清miR‑122 表达显著上调，miR‑122 部分的结果与禤文婷[3]等的研究结果基本一致，但对于miR‑122 作用的靶向信号通路仍需作进一步的研究与探讨。

综上，miR‑101及miR‑122水平在GDM产妇血清及胎盘中均呈高表达状态，其可能直接或间接参与了GDM 的发生和发展。此外，miR‑101 表达与胰岛素分泌指数呈负相关；miR‑122 表达则与胰岛素抵抗指数呈正相关，因此可推断，通过干预miR‑101 及miR‑122 表达，可阻止胰岛细胞功能的抑制或分泌，或可能成为GDM诊断、治疗及预后的新靶点。