超高效液相色谱质谱联用法测定血液中伊维菌素和丙硫苯咪唑的残留量

方雅莉 （广东医科大学科研服务管理中心，广东东莞 523808）

伊维菌素（IVM）和丙硫苯咪唑（BZs）是广泛应用于家畜的高效、广谱、低毒抗生素类抗寄生虫药物[1‑2]，也是目前国内使用较为广泛的抗寄生虫药[3]。市面上销售的一种名为“百虫灵”的广谱杀虫剂同时含有IVM 和BZs 成分，由于IVM 脂溶性较高，具有神经毒性和发育毒素，在体内残留时间较长，因此按照世界卫生组织5 级分类标准，它被列为高毒化合物。苯并咪唑类药物在体内转化的代谢物具有毒理作用，因此有必要针对IVM 和丙硫苯咪唑建立一种快速、高效的检测方法。本文以超高效液相色谱质谱联用仪中液相色谱法对血样中的IVM和BZs进行了检测。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

IVM 标准物质(98.5%），美国百灵威科技有限公司；BZs 标准物质，美国AccuStandard 公司；甲醇色谱纯(HPLC），德国默克公司；乙腈色谱纯（HPLC），德国默克公司；乙酸铵色谱纯（HPLC），美国西格玛公司；甲酸色谱纯(HPLC)，安普科技有限公司。空白血1份。

1.2 仪器和设备

Exion LC‑MS/MS 超高效液相色谱‑三重四极杆质谱联用仪，美国ABSCIEX 公司；振荡器德国艾卡（IKA）公司；电子天平日本岛津公司；超纯水器德国默克密理博公司；离心机美国西格玛公司；水浴氮吹仪瑞典拜泰齐公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理 取解冻的血样0.5 mL，边振荡边缓慢加入2.5 mL 乙腈，8 000 r/min 振荡5 min，10 000 r/min 离心5 min，将上清液分出，过0.22 μm 微孔滤膜，收集滤液，45 ℃氮吹近干，用初始流动相定容至0.5 mL，供检验。

1.3.2 溶液配制 系列标准工作溶液的配制：精确称取IVM、BZs 对照品适量，分别置于20 mL 的容量瓶中，用甲醇溶解并定容，超声促溶，并充分摇匀，配制成1 g/L 标准储备液，用移液枪各取适量标准储备液于体积分数为50%的甲醇水中，配制成100 mg/L 的混合工作液，用体积分数为50%的甲醇水梯度稀释至0.01、0.05、0.10、0.30、0.50 mg/L 的混合系列标准工作溶液。

1.3.3 液相色谱串联质谱条件 UPLC 色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，ID 1.7 μm）；流动相A：0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸铵的超纯水；流动相B：乙腈；流速：0.4 mL/min；进样体积：1 μL；梯度洗脱条件见表1。质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式，多扫描方式：多反应检测（MRM）。质谱离子源参数为CUR：30；CAD：Medium；IS：5 500；TEM：550；GSI：50；GS2：50。2 种化合物质谱参数见表2。

表1 梯度洗脱条件

表2 两种化合物质谱参数

1.4 数据处理

每组实验重复3次，结果取平均值。

2 结果

2.1 质谱条件优化

IVM准确分子量为874.5，BZs准确分子量265.3，分别配制500 μg/L，以注射的方式在正离子模式下进行一级质谱母离子全扫描，分子离子m/z 分别为892.5、266.1，IVM 为[+NH4+]的分子离子峰，丙硫苯咪唑为[+H+]的分子离子峰，自动优化确定最高及次高响应的二级离子m/z以及相应的DP、CE、CXP等参数，具体见表2。

2.2 色谱条件优化

本文分别研究了含有0.1%甲酸、5 mmol/L 醋酸铵和0.1%甲酸、5 mmol/L 醋酸铵的超纯水作水相；乙腈、甲醇作为有机相，以灵敏度和峰形作为评判条件，最终发现含有5 mmol/L醋酸铵和0.1%甲酸的超纯水作水相，乙腈作为有机相，选择梯度洗脱，以相对高的流速低比例的有机相作为起始流动相，提高分析效率和灵敏度。

2.3 样品的提取

本文采用较为简单的乙腈蛋白沉淀法，过程提取回收率约为92%，步骤简单，大大提高了样品前处理的效率。

2.4 方法的检测限和线性范围

在本文方法所确定的试验条件下，进行数据的采集与分析，以浓度分数为横坐标，峰面积为纵坐标y，分别绘制质量浓度为10～500 μg/L 的IVM 和BZs 标准品线性回归方程，计算相关系数。见图1～2。按照1.3.1 样品前处理的方法，分别测定IVM、BZs 0.5、1.0、5、10 μg/L的加标空白血样定量离子信噪比，根据信噪比（RS/N）>10 的定量下限要求，可知BZs 的检出限为5 μg/L，定量检出限为5 μg/L；IVM 的检出限为0.5 μg/L，定量检出限为1 μg/L。见图3～4。

图1 IVM标准曲线的线性回归

图2 BZs标准曲线的线性回归

图3 IVM定量下限的信噪比图谱

2.5 加标样品回收率

两种药物在10～5 000 μg/L 添加水平下，平均回收率为91.5%～93.2%，RSD 为2.1%～3.6%，提示本方法可以同时检测生物检材中的2种药物。见表3。

表3 IVM和BZs的标准曲线回归方程、相关系数、检出限及定量限

图4 BZs定量下限的信噪比图谱

3 讨论

IVM 和BZs在日常生产生活中应用广泛，目前有分别使用液相色谱法检测BZs[4‑5]和使用液相色谱质谱法、液相色谱法检测IVM[6‑11]的文献报道，未检索到使用超高效液相色谱质谱法对IVM 和BZs 进行检测的文献报道。本文以超高效液相色谱质谱联用仪中液相色谱法对血样中的IVM 和BZs 进行检测，仅需0.1～0.5 g样品，经90%的乙腈高速匀浆离心去蛋白，过微孔滤膜供检，操作简单，5 min 前能出峰，方法检出限低，分析快速。在样品前处理的方式上，目前常用的有QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）、固相萃取（Solid phase extraction，SPE）、液‑液萃取（Liquid‑liquid extraction，LLE）和分子印迹（Molecular imprinting technique，MIT）等技术，它们各有优点，但普遍存在前处理复杂、耗时长等缺点。本文采用乙腈直接沉淀蛋白过微孔滤膜的形式进行前处理，较为简单且耗时短。总之，本文建立的UPLC‑MS/MS 检测方法回收率、准确率高，具有高速、高分离度与高选择性、高灵敏度的特点，能完全满足生物体内、外IVM和BZs的残留检测和验证需要。