不同生长年限和同一年度不同月份胆木化学成分含量研究

张钰昕，周明艳，谢振蕊，李 丽，李湘怡，刘爱霞，张俊清，李晓亮

（海南医学院1.海南省热带药用植物研究开发重点实验室，2.天然药化教研室，海南海口571199）

胆木为茜草科乌檀属乔木乌檀（Nauclea offici⁃nalisPierre. ex Pitard）干燥的茎干和根。全年均可采收，砍成块片，晒干［1］，其味苦、性寒，具有清热解毒、消肿止痛的功效［2］。胆木为海南特色黎药，是海南省传统黎药重点研究药材之一。1977 年版中国药典与2011 年《海南省中药材标准》记载胆木的药用部位为干燥茎干及根［3］。胆木民间常用于治疗感冒发烧、肺炎、乳腺炎、泌尿系统感染、肠炎、痢疾、胆囊炎、下肢溃疡、脚癣感染及皮炎湿疹等病症［4，5］，外用治疗痈疖脓肿［6］。相关药理研究发现，胆木具有抗菌抗病毒及抗氧化［7］、抗炎［8］、抗肿瘤［9］、抗疟［10］和镇痛作用［11］。现代临床应用于治疗急性咽喉炎、急性结膜炎及上呼吸道感染等疾病［12］。

胆木化学成分的研究结果表明，该植物成分主要包括有生物碱［13］、五环三萜及其皂苷类［14］、环烯醚萜类［15］、酚酸类［16］、黄酮［19］和倍半萜［16］等化合物。其中生物碱为胆木的特征性成分，也是其主要的活性成分［17‐19］，目前，关于使用高效液相色谱‐质谱联用（LC‐MS）方法测定不同生长阶段的胆木茎质量标准研究未见报道。

本研究利用LC‐MS 方法检测不同生长年限胆木药材中异长春花苷内酰胺、naucleamide B、獐牙菜苷、绿原酸、喜果苷、原儿茶酸、短小舌根草苷、香草酸、隐绿原酸的含量和同一年度不同月份的胆木药材中异长春花苷内酰胺，绿原酸的含量，寻找胆木药材药用部位茎干活性成分的变化规律，初步给出胆木药材的最佳采收时间。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂、试药和样品

仪器：Prominence UFLC 液相色谱仪，日本岛津公司；通过Turbo V 离子源接口串联AB‐SCIEX API 4000+串联四级杆质谱仪，Analyst 软件控制数据采集和处理，美国AB 公司；XS105DU 十万分之一电子分析天平，瑞士梅特勒‐托利多公司；Lab Tower EDI 15 超纯水一体机（Thermo fisher 公司）；KQ‐100v 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

试剂：甲醇（HPLC 级）购自德国默克公司，甲酸（HPLC 级）购自Thermo fisher 公司；超纯水（超纯水机自制）。其他试剂均为分析纯级。

试药：异长春花苷内酰胺、naucleamide B、喜果苷、短小蛇根草苷单体为本实验室经ODS 色谱柱洗脱提取，经核磁、质谱等鉴定，纯度均大于98%；对照品獐牙菜苷、绿原酸、隐绿原酸、香草酸及原儿茶酸均购买自成都普瑞法科技开发有限公司，纯度均大于98%。

样品：不同生长年限的胆木茎干均采自海南省琼中县（采收1、2、3、5、8、9～10、11、14 年生胆木茎干部位，共8 批，24 个样品）。

同一年度不同月份的胆木茎干均采自海南省琼中县（采收时间为2018.06.19～2019.06.11，每半个月采收一次，共26 批，78 个样品）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 采用菲罗门Kinetex 5 μm Evo C18100Å 色谱柱（2.10 mm×50 mm，5 μm），柱温40 ℃，以水（含0.1%甲酸A）‐甲醇（B）流动相梯度洗脱，梯度洗脱程序：0～0.50 min（5%B），0.50～0.51 min（40%B），0.51～5.00 min（95%B），5.00～5.01 min（5%B），5.01～6.00 min（5%B）；流速0.8 mL/min，进样量5 μL。

1.2.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），负离子检测，GS1 为35 psi，GS2 为45 psi，帘气为30 psi，喷雾温度为600 ℃。各化合物优化多反应监测（MRM）参数见表1、2。

表1 各化合物优化多反应监测（MRM）参数（年限）Tab 1 Multi⁃reaction monitoring（MRM）parameters（years）for each compound optimization

1.3 溶液的制备

1.3.1 对照品溶液的制备 精密称取9 个化合物对照品异长春花苷内酰胺，naucleamide B ，獐牙菜苷，绿原酸，喜果苷，原儿茶酸，短小舌根草苷，香草酸，隐绿原酸各5 mg 置10 mL 容量瓶，加甲醇溶解至刻度得标准储备液。精密吸取混合得混合标准溶液。储存于−20℃，备用。

精密称取化合物对照品异长春花苷内酰胺，绿原酸各5 mg 置10 mL 容量瓶，加甲醇溶解至刻度得标准储备液。精密吸取混合标准溶液。储存于−20 ℃，备用。

1.3.2 样品溶液的制备 精密称取晾干粉碎后的茎皮样品0.5 g，加入甲醇（40∶1，v/w），超声波提取30 min。提取液经0.22 μm 微孔滤膜过滤取2 mL 冷藏存于−20 ℃冰箱中。滤液原液、滤液50、80 倍稀释后，分别5 μL 进样分析。

表2 各化合物优化多反应监测（MRM）参数（月份）Tab 2 Multi⁃reaction monitoring（MRM）parameters（months）for each compound optimization

1.4 方法学验证

1.4.1 标准曲线的测定 不同生长年限：采用外标法绘制9 个化合物的标准曲线，进行线性回归，得回归方程及相关系数。根据要求将标准品稀释，进样，得各化合物定量限（LOQ）。9 个化合物在各自线性范围线性良好（r>0.990 4）（表3），对照品溶液和胆木提取液LC–MS/MS 色谱图见图1、2。

表3 9 种化合物的回归方程、相关系数、线性范围Tab 3 Regression equation correlation coefficient and linear range of nine compounds

图1 对照品溶液LC‐MS/MS 色谱图Fig 1 LC‑S/MS chromatogram of reference solution

图2 提取液LC‐MS/MS 色谱图Fig 2 LC‑S/MS chromatogram of extract solution

同一年度不同月份：采用外标法绘制2 个化合物的标准曲线，进行线性回归，得回归方程及相关系数。根据要求将标准品稀释，进样，得各化合物LOD 和LOQ。2 个化合物在各自线性范围线性良好（r>0.990 4）（表4），对照品溶液和胆木提取液LC‐MS/MS 色谱图见图3、4。

表4 2 种化合物的回归方程、相关系数、线性范围Tab 4 Regression equation correlation coefficient and linear range of the two compounds

图3 对照品溶液LC–MS/MS 色谱图Fig 4 LC‑S/MS chromatogram of reference solution

1.4.2 精密度、稳定性、重复性和回收率实验 将一定浓度的混合标准品单日连续进样6 次分析，计算各个化合物峰面积的相对标准偏差（RSD）考察精密度；分别考察9 个化合物的精密度、稳定性及重复性（表5）。其精密度RSD 范围为1.3%～8.0%。

取胆木茎干提取液，分别于0、2、4、6、8、12 h 进样分析，计算各化合物浓度的RSD 值考察稳定性；胆木茎干中化合物的稳定性RSD 范围为0.8%～6.0%。

图4 提取液LC–MS/MS 色谱图Fig 4 LC‑S/MS chromatogram of extract solution

取胆木茎干提取液，各6 份，进样分析，计算各个化合物浓度的RSD 以考察重复性。胆木茎干中化合物的重复性RSD 范围为0.9%～9.1%。

精密称取已知含量胆木茎干0.5 g，向已知浓度样品中加入一定量的已知浓度混合标准溶液，进样检测，按照加样回收率公式计算：回收率（%）=（测得量‐原有量）/加入量×100% 。同时，考察在已知浓度的胆木茎干样品中加入9 个化合物后的加样回收率，见表5。9 个化合物的加样回收率平均值的范围为99.20%～102.55%，且其RSD 范围为1.06%～3.75%。表明本方法稳定，可靠。

表5 精密度、重复性、稳定性和回收率结果Tab 5 Precision，repeatability，stability and recovery results

1.5 样品测定

采集不同生长年限，以及同一年度不同月份的胆木药材样品，采用LC‐MS 法进行检测，结果使用GraphPad Prism 8 软件绘制折线图和柱状图。

2 结果

2.1 不同生长年限

采集胆木茎干样品为：1、2、3、5、8、9～10、11、14年生共24 份样品。样品分析测试中，未能检测到原儿茶酸和香草酸（检测限：原儿茶酸0.197 μg/g、香草酸0.003 2 μg/g），含量很少。胆木茎干在幼年期，测定的6 种活性成分含量都较低，在第3 年生长期时，6 种化学成分的含量有所升高，到第5 年，含量增长趋于稳定。随着生长年限延长，其各化学成分含量是比较稳定的状态。胆木中异长春花苷内酰胺等6 种活性成分含量情况折线图，见图5、表6。

图5 不同生长年限胆木药材中各成分含量变化趋势图Fig 5 Trend chart of changes in the content of various components in Nauclea officinalis of different years

表6 不同生长年限胆木茎干中化学成分的含量（μg/g，n=3，±s）Tab 6 Contents of chemical constituents in stem of Nauclea officinalis of different growth year（μg/g，n=3，±s）

表6 不同生长年限胆木茎干中化学成分的含量（μg/g，n=3，±s）Tab 6 Contents of chemical constituents in stem of Nauclea officinalis of different growth year（μg/g，n=3，±s）

年限1 年生2 年生3 年生5 年生8 年生9～10 年11 年生14 年生獐芽菜苷 Rsd(%)喜果苷 Rsd(%)绿原酸 Rsd(%)短小舌根草苷 Rsd(%)异长春花苷内酰胺 Rsd(%)隐绿原酸 Rsd(%)1.323±0.101 2.077±0.333 3.687±0.851 9.293±0.154 6.493±1.745 4.479±0.740 5.886±1.949 20.34±8.760 7.60 16.05 23.08 1.66 26.87 16.47 33.11 43.09 1.864±0.249 1.452±0.237 3.113±0.795 12.804±1.752 24.38±10.08 16.25±11.24 13.300±4.032 13.516±3.959 13.34 16.32 25.55 13.69 41.33 69.18 30.31 29.29 12.493±1.078 9.319±1.656 8.362±1.801 31.7282±0.45 177.781±1.53 79.83±1.60 136.00±7.03 96.57±5.35 8.63 17.77 21.54 64.44 6.49 2.00 5.17 5.54 0.929±0.092 0.783±0.097 2.722±0.603 25.78±0.12 65.37±5.66 57.06±3.04 46.01±4.90 52.21±2.69 9.93 12.41 22.14 0.48 8.66 5.34 10.65 5.15 202.75±25.76 79.86±14.57 2 060.9±677.4 13 841.73±606.83 13 296.94±2304.79 13 730.43±288.53 23 317.39±1091.36 17 730.43±375.62 12.71 18.24 32.87 4.38 17.33 2.10 4.68 2.12 1.53±0.08 1.83±0.44 2.15±0.51 8.578±1.806 10.89±4.24 7.755±1.857 15.67±5.18 10.52±3.42 5.15 23.86 23.78 21.06 38.90 23.95 33.04 32.48

2.2 同一年度不同月份

采集胆木茎干样品2018.06.19～2019.06.11，共26 批，78 个胆木茎干样品，胆木茎干中活性成分异长春花苷内酰胺的含量大约比绿原酸含量高一到二个数量级，绿原酸含量在1 年中处于波动状态，1年内出现3 个含量最高点。异长春花苷内酰胺和绿原酸含量情况，见图6、表7。

表7 不同采集月份胆木药材中代表性化学成分含量情况（μg/g，n=3，±s）Tab 7 The representative chemical composition content of Nauclea officinalis in different collection months（μg/g，n=3，±s）

表7 不同采集月份胆木药材中代表性化学成分含量情况（μg/g，n=3，±s）Tab 7 The representative chemical composition content of Nauclea officinalis in different collection months（μg/g，n=3，±s）

日期异长春花苷内酰胺 RSD(%)绿原酸 RSD(%)2019‐01‐03 2019‐01‐15 2019‐01‐29 2019‐02‐12 2019‐02‐26 2019‐03‐12 2019‐03‐26 2019‐04‐09 2019‐04‐26 2019‐05‐07 2019‐05‐28 2019‐06‐11 2018‐06‐19 2018‐07‐03 2018‐07‐17 2018‐07‐31 2018‐08‐14 2018‐08‐28 2018‐09‐11 2018‐09‐25 2018‐10‐09 2018‐10‐23 2018‐11‐06 2018‐11‐26 2018‐12‐04 2018‐12‐20 29 690.00±8 560.00 53 740.00±14 690.00 10 180.00±3 270.00 36 990.00±16 100.00 30 490.00±9 110.00 32 240.00±27 420.00 42 670.00±7 580.00 38 960.00±28 860.00 52 580.00±18 490.00 60 840.00±21 280.00 45 100.00±9 120.00 29 580.00±9 550.00 36 760.00±8 890.00 10 610.00±2 270.00 9 420.00±1 943.00 12 040.00±3 000.00 9 400.00±1 790.00 13 750.00±2 790.00 13 490.00±2 800.00 18 840.00±2 860.00 18 800.00±5 300.00 21 130.00±7 380.00 24 950.00±3 380.00 28 240.00±22 660.00 35 580.00±26 230.00 16 530.00±4 440.00 28.83 27.34 32.12 43.53 29.88 85.05 17.76 74.08 35.17 34.98 20.22 32.29 24.18 21.39 20.63 24.92 19.04 20.29 20.76 15.18 28.19 34.93 13.55 80.24 73.72 26.86 1 243.21±678.99 952.7±368.79 559.11±600.92 4 704.29±4 057.23 878.26±549.39 548.77±197.16 2 246.74±1 988.5 938.33±1 041.52 1 591.19±1 137.32 3 695.43±3 123.63 3 093.46±1 158.64 1 263.26±1 681.52 8 392.42±6 312.76 246.95±88.42 692.13±355.37 176.19±30.49 611.83±345.85 1 434.38±361.17 6 702.77±3 114 5 489.45±2 500.07 5 964.12±4 242.37 398.58±102.07 412.34±227.35 1 659.6±2 207.38 2 578.73±2 165.1 255.79±57.18 54.62 38.71 107.48 86.25 62.55 35.93 88.51 111.00 71.48 84.53 37.45 133.11 75.22 35.80 51.34 17.31 56.53 25.18 46.46 45.54 71.13 25.61 55.14 133.01 83.96 22.35异长春花苷内酰胺/绿原酸(含量比)23.88 56.41 18.21 7.86 34.72 58.75 18.99 41.52 33.04 16.46 14.58 23.42 4.38 42.96 13.61 68.34 15.36 9.59 2.01 3.43 3.15 53.01 60.51 17.02 13.80 64.62

图6 不同月份胆木药材中各成分含量变化趋势图Fig 6 Trend chart of the content of each component in Nauclea officinalis in different collection months

3 讨论

不同生长年限的胆木在幼年期，测定的6 种活性成分含量均较低，在3 年生长期后，6 种化学成分的含量开始同步升高，到5 年生长期后，含量趋于稳定。5 年以上生长期的胆木药材，其各化学成分含量是比较稳定的状态。生长年限在5 年以上的胆木，其茎中各成分含量达到了一个较高且稳定的水平。应采集5 年生以上的胆木作为药材原料。

同一年度不同月份的胆木茎干中主要含生物碱和酚酸类两类活性成分，相比之下，异长春花苷内酰胺的含量大约比绿原酸含量高一到二个数量级，且生物碱为胆木药材更为重要的活性成分，绿原酸含量在1 年中处于波动状态，1 年内出现3 个含量最高点，很难依据该成分的含量来确定胆木药材的品质。因此，以生物碱代表性活性成分异长春花苷内酰胺含量高低评价胆木药材的品质更具有现实意义。

关于胆木药材的采收时间，原有标准规定全年采收［1］，经过实验测定不同活性成分含量得知，以异长春花苷内酰胺含量高而稳定的月份即每年的5月作为胆木一年内最佳采收时间，最佳采收期为每年的10月中旬至次年的6月中旬，或者每年的3～5月。

作者贡献度说明：

张钰昕：提出研究思路、设计研究方案、负责含量测定方法学验证、负责样品含量测定、论文起草；周明艳：设计研究方案、分析数据、论文起草；谢振蕊、李丽：负责实验材料购买、整理数据、采集数据；刘爱霞、李湘怡：分析数据、处理数据；张俊清：提供研究经费、实验仪器、实验场地；李晓亮：提供技术支持、对论文进行修改指正。