基于网络药理学探讨藏红花抗动脉粥样硬化的作用机制

杨 静，任 星，张菀桐，高 蕊

（1.北京中医药大学研究生院，北京100029；2.中国中医科学院西苑医院，北京100091）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种常见的重要血管疾病，通常从受累动脉内膜开始，先后出现多种病变，包括脂质和复合糖类的局部积聚、纤维组织增生、钙质沉积形成斑块和动脉中膜的退变［1］。目前心脑血管疾病对人类的生命健康已构成了严重的威胁［2，3］，AS 作为心脑血管疾患的重要危险因素，发病率逐年增高，且呈现一定的年轻化趋势，严重危及人类健康。因此，有效防治AS 成为了预防心脑血管疾病发生的关键［4］。目前抗AS 的治疗主要通过他汀类降脂药物进行干预，但其长期用药的安全性备受争议。刘昌孝［5］在对他汀类药物的安全性风险评价中发现该类药物具有肝损害、增加癌症风险以及造成骨骼肌损害等不良反应。中医认为痰浊、瘀血、毒邪（热毒）阻滞损伤脉络，日久脉络瘀阻，是AS 发生的病机［6］，中医中药治疗AS 具有独特优势及特色，多通过化痰泄浊、活血化瘀、清热解毒等进行治疗［7］。

藏红花，又名“西红花”、“番红花”，为鸢尾科植物番红花的干燥柱头，性味甘、微寒，归心、肝经，功能活血化瘀，凉血解毒，解郁安神，适用于经闭癥瘕，产后瘀阻，温毒发斑，忧郁痞闷，惊悸发狂［8］。目前已有较多研究报告了藏红花对心脑血管疾病的治疗，认为藏红花酸可能是其作用的物质基础［9］。有学者利用藏红花酸干预AS 大鼠模型发现其可以下调大鼠主动脉LOX-1 的表达，对AS 具有一定的疗效。Asdaq 等［11］给予血脂异常大鼠藏红花提取液，与对照组进行比较，藏红花可显著调节大鼠脂代谢紊乱从而到达抗AS 效果。以上研究表明，藏红花具有一定的抗AS 作用，但其具体作用成分和机制尚未完全明确。

网络药理学作为药理学的分支学科，运用网络方法分析药物与疾病及其靶点间的“多成分、多靶点、多途径”的协同作用关系，各中药在不同方剂中的配伍及加减运用亦体现了其多成分、多靶点、多途径的特性，两者特点相一致［12］。因此，本研究基于网络药理学的方法分析藏红花抗AS 的活性成分及其作用机制，以指导临床用药并为下一步的药理研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 获取藏红花药物候选靶点

登录中药系统药理学数据库和分析平台（TC‐MSP Databases），搜索并获取藏红花的药物化学成分，根据类药性≥0.18 进一步筛选藏红花的有效化合物。根据药物已知成分，在TCMSP Databasess 及Genecards Databases 获取成分作用靶点，将获取的靶点进行去重处理，排除重复靶点。运用Uniprot 数据库査询靶点蛋白对应的基因简称，得到藏红花调控的疾病靶点。构建候选药物成分-候选靶点网络图（candidate compound-candidate target network，cCcT network）

1.2 获取AS 靶点

登录DisGeNET 数据库获取疾病药物作用靶点，以atherosclerosis（动脉粥样硬化）为关键词，人类基因为背景，提取数据库中信度较高（score>0.001）的相关基因靶点，进行去重、统一名称等处理，获取疾病相关基因。 将所获取的基因导入Cyto‐scape3.7.2 软件中构建分子网络，并进行可视化加工和拓扑结构分析，得到疾病-靶点网络（Disease-po‐tential target network，D-pT network）。

1.3 藏红花成分-AS 靶点网络构建

通过映射cC-cT network 于D-pT network，得到藏红花药物成分治疗AS 的靶点，应用Cyto‐scape3.7.2 软件构建药物-候选成分-AS 的候选靶点网 络（Herb-potential compound-potential target net‐work，H-pC-pT network）。

1.4 GO 生物进程及KEGG 通路分析

将cC-cT network 与D-pT network 的映射基因导入Cytoscape3.7.2 软件的ClueGO 插件中进行GO生物进程及KEGG 通路富集分析。

2 结果

2.1 藏红花药物化学成分筛选

利用TCMSP 数据库，以藏红花、西红花、番红花为检索词，以类药性≥0.18 为条件筛选得到20 个化合物，并参考相关文献加入2 个藏红花常用活性成分［13，14］，共 得 到22 个 藏 红 花 的 有 效 活 性 成 分。见表1。

表1 藏红花活性成分基本信息Tab 1 Basic information of active components in saffron

2.2 藏红花药物候选靶点筛选

将上述获得的22 个藏红花活性成分引入TC‐MSP 数据库及Genecards 数据库，获得16 个活性成分对应113 个疾病靶点（其中有6 个活性成分的疾病靶点未被TCMSP 数据库及Genecards 数据库收录）。将上述获得的藏红花作用靶点输入到Uniprot数据库中査询靶点蛋白对应的基因简称，剔除非人源靶点后最终得到藏红花调控的疾病靶点106 个。构建候选药物成分-候选靶点网络。见图1。该网络共包含123 个节点，271 条边。其中16 个节点代表藏红花活性成分，106 个节点代表活性成分作用的疾病靶点，255 条边代表成分与靶点之间的作用关系。越靠近中心的靶点在网络中度越高，说明藏红花中有多种药物成分作用于该靶点。

图1 藏红花成分-靶点网络图Fig 1 Target network of saffron composition

2.3 AS 候选靶点筛选

应用DisGeNET 数据库，以atherosclerosis 为关键词检索，获得数据库中信度较高（score>0.001）的相关基因靶点共117 个。利用Cytoscape3.7.2 软件进行可视化加工和拓扑结构分析，构建疾病-靶点网络，该网络包含118 个节点，2 151 条边，越靠近内层说明该靶点与疾病的相关度越高。见图2。

图2 疾病-靶点网络图Fig 2 Disease-target network

2.4 藏红花成分-AS 靶点网络构建

将藏红花药物候选靶点网络（cC-cT network）映射于AS 靶点网络（D-pT network），结果提示，藏红花作用于26 个疾病靶点。见表2。应用Cyto‐scape3.7.2 软件构建药物-候选成分-AS 的候选靶点网络（H-pC-pT network）。该网络包含39 个节点，101 条边。其中11 个节点代表藏红花活性成分，26个节点代表藏红花作用于AS 的靶点（基因简称）。在网络中，一个节点的度表示网络中和节点相连路线的条数。在化合物方面，有3 个化合物的度值≥6，分别是藏红花酸（crocetin），异鼠李素（isorhamne‐tin），槲皮素（quercetin）。提示在藏红花治疗AS 的过程中，藏红花酸、异鼠李素、槲皮素3 种化学成分可能起主要作用。在化合物作用的疾病靶点方面，有4个靶点的相关度值较高，分别是内皮型一氧化氮合酶（NOS3），凝血酶（F2），过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG），前列腺素G/H 合酶2（PTGS2）。说明在藏红花治疗AS 的过程中，作用的主要靶点是内皮型-氧化氮合酶，凝血酶，过氧化物酶体增殖物激活受体γ 及前列腺素G/H 合酶2。这体现了藏红花多成分与多靶点之间共同作用的机制。见图3。

表2 中药藏红花活性成分抗动脉粥样硬化的靶点Tab 2 Targets of saffron active components against athero⁃sclerosis

图3 药物-候选成分-动脉粥样硬化的候选靶点网络Fig 3 Drug-candidate component-atherosclerosis candidate target network

2.5 藏红花与AS 相互关系的GO 生物进程分析及KEGG 通路研究

将藏红花作用于AS 的26 个基因靶点导入Cy‐toscape3.7.2 软件的ClueGO 插件中进行GO 及KEGG 通路富集分析，得到藏红花治疗AS 相互关系的GO 生物进程及KEGG 通路结果。

2.5.1 生物进程聚类分析结果 通过GO 生物进程分析，获得12 个藏红花治疗AS 生物进程。见图4。图中面积越大，表示聚类至此生物功能的映射靶点越多，可得知藏红花治疗AS 可能主要是通过参与影响以下体内生物进程：（1）活性氧代谢过程的正调控；（2）调节平滑肌细胞增殖；（3）活性氧生物合成过程；（4）胶质细胞增殖的正调控；（5）趋化因子的生物合成过程等。

图4 藏红花抗AS GO 生物进程聚类分析结果Fig 4 Cluster analysis results of saffron anti-AS and GO biological process

2.5.2 KEGG 聚类分析结果 为进一步探究藏红花抗AS 的具体机制，开展KEGG 通路探索，共获得23 个信号通路，将其中与AS 相关的通路作为研究候选通路，包括：（1）VEGF 信号通路；（2）糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路；（3）流体剪切应力与动脉粥样硬化通路；（4）NF-kappaB 信号通路。见图5。

图5 藏红花抗AS KEGG 通路Fig 5 KEGG pathway of saffron in the treatment of atherosclerosis

2.5.3 基于网络药理学初步探索藏红花抗AS 的作用机制 结合上文藏红花与AS 相互关系的GO 生物进程及KEGG 通路结果。可得知藏红花抗AS 的相关通路包括VEGF 信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路和NF-kappaB 信号通路。通过查询上述通路在KEGG 数据库中的相关作用并结合既往文献，初步建立藏红花抗AS 的相关通路示意图。见图6。

图6 藏红花抗AS 相关通路示意图Fig 6 Pathway of saffron in treatment of atherosclerosis

3 讨论

本研究运用网络药理学方法，通过分析藏红花与AS 分子网络在生物功能方面的异同，初步探索藏红花抗AS 的作用机制。GO 生物进程聚类分析和KEGG 通路聚类分析表明藏红花抗AS 可能主要通过参与活性氧代谢过程的正调控、调节平滑肌细胞增殖、活性氧生物合成过程、胶质细胞增殖的正调控、趋化因子的生物合成过程等生物进程。在信号通路的调控方面，藏红花抗AS 可能主要调控VEGF信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路和NF-kap‐paB 信号通路。晚期糖基化终产物（AGEs）是由蛋白质、脂质和核酸的非酶促糖基化和氧化产生的一组复杂的化合物［15］。RAGE 作为AGE 的模式识别受体，属于免疫球蛋白超家族细胞表面分子的多配体受体，与积极参与炎症和免疫反应的配体相结合［16］。

AGE/RAGE 信号传导引起涉及NADPH 氧化酶、蛋白激酶C 和MAPKs 的多个细胞内信号途径的激活，从而导致NF-κB 活化［1-19］。NF-κB 能促进促炎性细胞因子（如IL-1、IL-6 和TNF-α）以及与AS 相关的 基 因 血 管 内 皮 生 长 因 子（VEGF）的 表 达［20］。VEGF 能特异性地促进血管内皮细胞有丝分裂的生长因子，刺激内皮细胞合成氧化氮并上调氧化氮合酶的表达，促进新生血管形成［21］。新生血管管壁不完整，通透性强，可为斑块局部提供养分，进一步促进AS 的发展［22］。剪切应力代表了血流施加在血管壁内皮表面的摩擦力，它在血管生物学中起着核心作用，并有助于AS 的发展［23］。低剪切应力通常会上调内皮细胞（EC）基因和蛋白，从而促进动脉壁的氧化和炎症状态，导致AS［24］。反映这种ECs 紊乱状态的重要转录事件包括激活蛋白1 和核因子kappaB 的激活［25］。化合物-疾病靶点网络分析显示，藏红花治疗AS 的主要有效成分为藏红花酸、异鼠李素、山奈酚和槲皮素。有研究表明藏红花酸是一种天然的类胡萝卜素二羧酸，在体内和体外模型中都有促血管生成的作用，可以通过调节VEGF 信号通路促进血管内皮细胞血管生成［26］。藏红花酸还能增加HO-1/NRF-2 的表达，降低核因子-κB（NF-κB）mRNA 和蛋白的表达，从而抑制AS 形成［27］。异鼠李素是从中草药沙棘中提取的黄酮类化合物，具有抗氧化和抗炎的作用［28］。一项动物实验表明，异鼠李素能够抑制小鼠体内TNF-α、IL-6 的产生，发挥抗炎作用［29］。槲皮素是一种中草药中提取的黄酮类化合物。已有研究证实了它的抗炎、抗癌、抗氧化和抗凋亡活性［30］。槲皮素通过ROS 调节的PI3K/AKT 信号通路抑制炎症和凋亡，从而减轻高果糖喂养诱导的动脉粥样硬化。槲皮素通过减少活性氧的产生、抑制细胞凋亡和炎症反应，从而抑制高果糖所致的动脉粥样硬化［30］。

由此，笔者推测，藏红花抗AS 可能主要通过藏红花酸、异鼠李素及槲皮素等有效化学成分发挥抗炎及抑制血管新生的作用。