西伯利亚白刺叶化学成分及其抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究

李永丽，王海美，波拉提·马卡比力，田从魁，吴增宝*（1.中牟县人民医院药学办，郑州451450；.湖北民族大学化学与环境工程学院，湖北 恩施 445000；3.新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐 830004；4.中央民族大学民族医药教育部重点实验室，北京 100081）

西伯利亚白刺（Nitraria sibiricaPall.）是蒺藜科白刺属植物，分布于蒙古、中亚、西伯利亚和中国；在中国主要分布于各沙漠地区[1]。与同属唐古特白刺果实统称白刺，在维药和蒙药中均有记载。其叶和果实均可入药[2]。西伯利亚白刺为传统的维药，其叶可被用于治疗高血压、高血糖等症[3]。但是对于其发挥活性的物质基础并不明确。本课题组前期在降血糖药物筛选过程中，发现西伯利亚叶的总提取物具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，为进一步分离其活性成分并研究其降糖机制，对产于新疆沙湾县郊区的西伯利亚白刺叶的化学成分进行了研究，从中分离得到10个化合物，并测定了其中单体化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1 材料

ACQUITY QDa质谱仪[美国Waters公司，电喷雾质谱（ESI-MS）条件为正、负离子电离模式，扫描范围m/z100～2000，质量数均经过校正，毛细管电压2 V]。采用ESI电喷雾离子源，离子源温度200℃，锥孔气为氮气，碰撞气为氦气。锥孔电压35～60 kV，碰撞电压15～35 V）。1H-NMR和13C-NMR由Varian 600 MHz型超导核磁共振仪测定（Varian公司），TMS为内标；X-4型熔点测定仪（北京泰克仪器有限公司），柱色谱用硅胶（200～300目）和薄层色谱用硅胶G（青岛海洋化工产品）。葡聚糖凝胶Sephadex LH-20和ODS反相硅胶（Pharmacia公司）。半制备色谱仪（Waters 600型），色谱甲醇和乙腈（Fischer公司），水为Milli Q超纯水，其他化学试剂均为分析纯。Multiskan MK3 酶标仪（美国Thermo Electron公司）；LRH-150恒温培养箱（上海一恒科技有限公司），万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

西伯利亚白刺叶子采于新疆沙湾县，经湖北民族大学化学与环境工程学院吴增宝副教授鉴定为西伯利亚白刺（Nitraria sibiricaPall.）的叶。标本存于湖北民族大学化学与环境工程学院标本室（编号：No.20130604-1）。

α-葡萄糖苷酶（批号：EC 232-604-7）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPG，批号：EC 223-189-3）（Sigma公司），阿卡波糖（批号：100808-200501，中国食品药品检定研究院），各单体化合物均用DMSO溶解，用磷酸缓冲液配成不同浓度。

2 方法与结果

2.1 提取分离

取干燥后西伯利亚白刺叶3.0 kg，粉碎成粗粉，95%乙醇回流提取3次，每次1 h，回收乙醇得到浸膏1500 g，取300 g浸膏用硅胶柱色谱分离，氯仿∶甲醇（100∶0～2∶1，V/V）梯度洗脱，得到Fr1～65。其中Fr6析出针羽状结晶，经95%乙醇重结晶后得到化合物1（160.0 mg），Fr10～15合并，经反相硅胶柱色谱和葡聚糖凝胶色谱纯化得到化合物3（20.2 mg）、化合物5（14.2 mg）和化合物6（18.1 mg），Fr20～30合并经反相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶色谱半制备液相色谱，得到化合物2（14.6 mg）、化合物4（13.8 mg）、化合物7（23.3 mg）和化合物8（12.3 mg），Fr.45～50合并，经反相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱纯化后，再经过Waters 600半制备纯化，得到化合物9（17.1 mg）和化合物10（15.7 mg）。化合物1～10的结构见图1。

图1 化合物1～10的结构Fig 1 Sturctures of compound 1～10

2.2 结构鉴定

化合物1：白色针羽状结晶。熔点134～138℃。与β-谷甾醇薄层对照，Rf值一致，故鉴定其为β-谷甾醇。

化合物2：白色粉末。UVλmax（MeOH）：309 nm；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：6.28（1H，d，J＝16.8 Hz，H-8），6.80（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3，5），7.42（1H，d，J＝16.8 Hz，H-7），7.48（2H，dd，J＝8.4 Hz，H-2，6）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：125.6（C-1），129.8（C-2，6），115.7（C-3，5），159.6（C-4），142.8（C-7），114.6（C-8），168.9（C-9）。以上数据与文献[4]报道的（E）-香豆酸一致，故鉴定其为（E）-香豆酸。

化合物3：黄色针羽状结晶（甲醇）。熔点274～276℃。UVλmax（MeOH）：255 nm，367；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.56（1H，s，5-OH），10.81（1H，s，4'-OH），10.03（1H，s，7-OH），8.02（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2'，6'），6.90（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3'，5'），6.42（1H，d，J＝2.4 Hz，H-8），6.15（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：146.6（C-2），135.3（C-3），176.5（C-4），157.4（C-5），97.8（C-6），164.5（C-7），93.2（C-8），161.9（C-9），103.6（C-10），122.2（C-1'），129.9（C-2'，6'），115.2（C-3'，5'），160.8（C-4'）。以上数据与文献[5]报道的山柰素一致，故鉴定化合物3为山柰素。

化合物4：白色粉末。熔点：207～209℃。UVλmax（MeOH）：260 nm，293；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.46（2H，m，H-2，6），6.80（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5），3.80（3H，s，3-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：121.1（C-1），113.9（C-2），147.5（C-3），150.7（C-4），112.8（C-5），123.2（C-6），167.0（COOH），55.5（3-OCH3）。以上数据与文献[6]报道的香草酸一致，故鉴定化合物4为香草酸。

化合物5：淡黄色粉末（甲醇），熔点：259～263℃。UVλmax（MeOH）：267，330 nm；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.98（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2'，6'），7.02（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3'，5'），6.71（1H，s，H-3），6.30（1H，d，J＝2.4 Hz，H-8），6.05（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6），3.83（3H，s，4'-OCH3），13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：162.2（C-2），103.5（C-3），180.5（C-4），161.5（C-5），100.2（C-6），169.5（C-7），94.5（C-8），157.5（C-9），101.5（C-10），121.5（C-1'），128.6（C-2'，6'），114.9（C-3'，5'），162.5（C-4'），55.8（4'-OCH3）。以上数据与文献[7]报道的5，7，3'，4'-四羟基黄酮醇一致，即金合欢素（acacetin），故鉴定化合物5为金合欢素。

化合物6：黄绿色粉末，熔点：312～315℃。UVλmax（MeOH）：256，374 nm；1H-NMR（600 MHz，acetone-d6）δ：12.33（1H，s，5-OH），9.90（1H，s，OH），8.54（1H，s，OH），8.31（1H，s，OH），8.01（1H，s，OH），7.88（1H，d，J＝2.4 Hz，H-2'），7.75（1H，dd，J＝8.4，2.4 Hz，H-6'），7.04（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5'），6.58（1H，d，J＝1.8 Hz，H-8），6.24（1H，d，J＝1.8 Hz，H-6）。以上数据与文献[8]报道的5，7，3'，4'-四羟基黄酮醇一致，即槲皮素（quercetin），故鉴定化合物6为槲皮素。

化合物7：淡黄色粉末（甲醇），熔点：345～347℃。UVλmax（MeOH）：264，336 nm；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.90（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2'，6'），7.00（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3'，5'），6.77（1H，s，H-3），6.44（1H，d，J＝1.8 Hz，H-8），6.10（1H，d，J＝1.8 Hz，H-6），13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：164.2（C-2），103.2（C-3），181.9（C-4），161.9（C-5），99.2（C-6），164.5（C-7），94.7（C-8），157.7（C-9），104.5（C-10），121.8（C-1'），129.1（C-2'，6'），116.5（C-3'，5'），161.9（C-4'）。以上数据与文献[9]报道的5，7，4'-三羟基黄酮一致，即芹菜素（apigenin），故鉴定化合物7为芹菜素。

化合物8：无色针晶（甲醇）。UVλmax（MeOH）：259，291 nm；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.42（1H，s，COOH），9.39（1H，s，OH），9.25（1H，s，OH），7.30（1H，d，J＝1.2 Hz，H-2），7.26（1H，dd，J＝8.4，1.2 Hz，H-6），6.74（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5），13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：121.9（C-1），116.7（C-2），144.5（C-3），150.3（C-4），115.5（C-5），121.8（C-6），167.9（C＝O）。以上数据与文献[10]报道的原儿茶酸（protocatechuic acid）一致，故鉴定化合物8为原儿茶酸。

化合物9：淡黄色粉末（甲醇），熔点：201～204℃。UVλmax（MeOH）：266，337 nm；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.90（1H，s，5-OH），10.62（1H，s，4'-OH），7.96（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2'，6'），7.03（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3'，5'），6.74（1H，s，H-3），6.61（1H，d，J＝2.4 Hz，H-8），6.22（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6），5.12（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1''），3.22～3.68（9H，m，H-2''-5''，6''a，2'''-5'''），3.90（1H，m，H-6''b），4.62（1H，br s，H-1'''），1.13（3H，d，J＝6.0 Hz，H-6'''）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：164.5（C-2），103.3（C-3），182.9（C-4），161.7（C-5），99.4（C-6），162.5（C-7），94.6（C-8），157.5（C-9），104.8（C-10），120.8（C-1'），128.1（C-2'，6'），116.2（C-3'，5'），161.2（C-4'），98.9（C-1''），73.1（C-2''），76.2（C-3''），69.4（C-4''），75.6（C-5''），66.2（C-6''），100.8（C-1'''），70.1（C-2'''），70.5（C-3'''），72.2（C-4'''），68.2（C-5'''），17.5（C-6'''）。以上数据与文献[11]报道的5，7，4'-三羟基黄酮一致，即芹菜素-7-O-芸香糖苷，故鉴定化合物9为芹菜素-7-O-芸香糖苷。

化合物10：淡黄色粉末（甲醇），熔点：223～226℃。UVλmax（MeOH）：266，348 nm；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.97（1H，s，5-OH），7.99（2H，d，J＝9.0 Hz，H-2'，6'），6.93（2H，d，J＝9.0 Hz，H-3'，5'），6.47（1H，d，J＝1.8 Hz，H-8），6.20（1H，d，J＝1.8 Hz，H-6），5.30（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1''），3.11～3.72（10H，m，H-2''-6''，2'''-5'''），4.42（1H，br s，H-1'''），1.10（3H，d，J＝6.0 Hz，H-6'''）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：156.6（C-2），133.7（C-3），178.1（C-4），161.2（C-5），99.0（C-6），163.4（C-7），94.1（C-8），156.9（C-9），104.0（C-10），120.8（C-1'），130.1（C-2'，6'），115.4（C-3'，5'），160.3（C-4'），101.2（C-1''），74.4（C-2''），76.5（C-3''），69.6（C-4''），75.8（C-5''），66.4（C-6''），100.9（C-1'''），70.3（C-2'''），70.6（C-3'''），72.0（C-4'''），68.0（C-5'''），17.4（C-6'''）。以上数据与文献[12]报道的山柰素-3-O-芸香糖苷一致，故鉴定化合物10为山柰素-3-O-芸香糖苷。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

以p-NPG为底物，阿卡波糖为阳性对照，共设5个组，每组设3个复孔，分别为A.空白组（缓冲液＋酶液＋底物）；B.空白对照组（缓冲液＋底物）；C.样品测定组（样品＋酶液＋底物）；D.样品对照组（样品＋缓冲液）；E.阳性对照组（阿卡波糖＋酶液＋底物）。每孔加入120 μL样品或阿卡波糖的缓冲溶液（加少量DMSO助溶）和20 μLα-葡萄糖苷酶的缓冲溶液（空白组和对照组只加缓冲溶液），温育15 min；每孔加入20 μL 5 mmol·L－1的p-NPG的缓冲溶液，温育15 min，加入20 μL Na2CO3终止溶液，酶标仪于405 nm下测定OD值。抑制率（%）＝[1－（ODC－ODD）/（ODA－ODB）]×100%。在初筛有活性基础上，再设计7～8个浓度，以浓度的对数-抑制率用Oringin软件作图，计算IC50值。结果β-谷甾醇（1）、（E）-香豆酸（2）、香草酸（4）、原儿茶酸（8）在1000 μg·mL－1对α-葡萄糖苷酶的抑制率低于50%，活性很弱；山柰素（3）、金合欢素（5）、槲皮素（6）、芹菜素（7）、芹菜素-7-O-芸香糖苷（9）、山柰素-3-O-芸香糖苷（10）均有较好活性，IC50分别为30.4、53.0、15.2、45.9、248.4、176.4 µmol·L－1。阿卡波糖的IC50为217.0 µmol·L－1。

3 讨论

本研究首次对西伯利亚白刺叶进行了化学成分的分离，得到10个单体化合物，其中6个黄酮类、3个酚酸类和1个甾醇类成分。除β-谷甾醇外都为黄酮类或酚酸类成分，这与白刺属植物所含的次生代谢产物相符，也与该属植物所含黄酮类型相同（主要为黄酮醇类）。提示以黄酮类成分作为该属特征成分并作为化学分类学是有一定的科学依据的。经查阅文献，从西伯利亚叶中分离所得到的槲皮素具有抗炎抗氧化和心血管保护、降血糖等多种活性[13]，山柰素具有抗炎抗氧化和降血糖等多种活性[14]、金合欢素具有抗炎抗氧化和心脏保护等多种药理作用[15]、芹菜素具有抗炎抗氧化和心血管保护等活性[16]，α-葡萄糖苷酶的抑制活性测试结果表明，分离得到的几种黄酮类成分均具有较好的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，且苷元的活性普遍强于苷的活性，提示白刺提取物的黄酮类成分可能是其降血糖作用的主要活性成分，可以作为降血糖的药物进一步开发，但是除α-葡萄糖苷酶的抑制活性以外是否还有别的降糖机制，需要进一步研究阐明。