甘草提取物的不同馏分对变形链球菌的体外抑制作用

杨若琪, 赵贵萍, 李 泉*

(1. 山东中医药大学 药学院, 山东 济南 250355; 2. 潍坊医学院附属医院 中医科, 山东 潍坊 261000; 3. 云南中医药大学 中药学院, 云南 昆明 650500)

龋齿是一种由口腔致病菌引起的局部感染性疾病[1].食物、宿主以及微生物都在龋齿的形成过程中起着重要的作用[2].在人类口腔环境的多种细菌中,变形链球菌具有较强的产酸性以及形成生物被膜的能力,被认为是主要致龋病原体[3].使用抗菌药物(例如氟化物或洗必泰)是目前预防龋齿的主要策略之一[4].然而,当抗菌药物对病原菌起作用时,益生菌在口腔中的生长也受到了影响,这可能会导致口腔菌群的失调以及牙渍和味觉改变等副作用的发生[5].在过去的几年中,研究人员对来源于植物的天然化合物产生了极大的兴趣,这些化学治疗药物的细胞毒性较低,并且具有潜在的抗龋活性[6].

作为应用最广泛的传统中药,甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)具有止咳、抗炎和抗菌的功效,其药理活性主要存在于以甘草素为代表的黄酮类化合物(flavonoids)和以甘草酸、甘草次酸为代表的三萜皂苷类化合物(triterpenoid saponins)中[7].研究显示,甘草中的一些活性化合物对牙齿疾病已经表现出了不同程度的治疗作用[8].本文通过测定甘草提取物的不同馏分对变形链球菌浮游细胞代谢活性、生物被膜形成以及产酸性的影响,为抗龋药物的研发提供新的思路.

1 材料与方法

1.1 材料

甘草药材(康美药业股份有限公司)、变形链球菌UA159(山东中医药大学微生物教研室提供)、脑心浸液培养基(BHI,北京奥博星生物技术有限公司)、噻唑蓝(MTT,5 mg·mL-1,江苏凯基生物技术有限公司).

1.2 主要仪器设备

96孔板(南通海之星实验器材公司)、2.5 L厌氧产气包(青岛海博生物科技有限公司)、DNM-9602型酶标仪(北京普朗公司)、PHS-3C型pH计(上海虹益仪器仪表有限公司).

1.3 方法

1.3.1 甘草粗提物的制备以及各馏分的萃取

甘草粗提物的制备根据蔡昀盈等[9]的方法并稍加修改.将甘草药材干燥并用搅拌机压成粉末,按照1∶8(g·mL-1)的料液比加入体积分数为90%乙醇作为提取剂,在80 ℃水浴回流提取2 h后,将提取物过滤并加入相同体积的提取剂重复上述过程1次.合并2次所得的滤液,经旋蒸浓缩后,用无菌蒸馏水溶解获得甘草粗提物,依次使用石油醚、乙酸乙酯和乙醇按照1∶3的体积比萃取3次,得到各有机层的馏分.

1.3.2 MTT试验

将变形链球菌UA159过夜培养至生长对数期,用BHI培养基稀释至菌落数为5×105CFU·mL-1.将甘草提取物的不同馏分在96孔板中通过倍比稀释法配置成一系列所需质量浓度,与细菌在2.5 L厌氧产气包中共同孵育24 h.将10 μL的MTT加入到每个孔中,37 ℃避光反应3 h后再向每个孔中加入二甲基亚砜溶液.使用酶标仪测量490 nm处的吸光度,试验进行3次重复.

1.3.3 生物被膜形成试验

过夜培养的变形链球菌UA159菌液用含有质量浓度为0.25 g·mL-1的蔗糖BHI培养基稀释至菌落数为1×107CFU·mL-1.将倍比稀释的药物与细菌在厌氧环境中共同孵育24 h,然后小心除去每个孔中的上清液,并用无菌磷酸缓冲盐溶液洗涤形成的生物被膜.使用体积分数为0.4%结晶紫溶液对生物被膜进行染色,再次用无菌磷酸缓冲盐溶液洗去多余的染料,最后加入体积分数为33%乙酸溶液静置15 min.使用酶标仪测量590 nm处的吸光度,试验进行3次重复.

1.3.4 糖酵解pH值下降试验

将菌落数为1×107CFU·mL-1的变形链球菌UA159与不同质量浓度的药物一起添加到96孔板中.在将初始pH值调节至7.1后,每隔2 h测量1次每个孔的pH值,试验进行3次重复.

1.3.5 统计学方法

数据采用SPSS统计软件(IBM SPSS Statistics 25, USA)进行单因素方差分析(ANOVA).结果以均数±标准差(SD)表示.当P< 0.05时认为差异有统计学意义.

2 试验结果

2.1 甘草提取物的不同馏分对变形链球菌浮游细胞代谢活性的影响

用甘草提取物的不同馏分处理变形链球菌浮游细胞24 h后,结果如图1所示.8 mg·mL-1的粗提物与对照组相比相对降低了变形链球菌浮游细胞约70%的代谢活性(P< 0.01),5 mg·mL-1的乙醇馏分则相对降低了约80%的代谢活性(P< 0.01).乙酸乙酯馏分的抑制效果最为明显,质量浓度为3 mg·mL-1时能够相对降低约75%的代谢活性(P< 0.01).

(a) 粗提物质量浓度对浮游细胞代谢活性的影响(b) 乙醇质量浓度对浮游细胞代谢活性的影响(c) 乙酸乙酯质量浓度对浮游细胞代谢活性的影响

2.2 甘草提取物的不同馏分对变形链球菌生物被膜形成的影响

通过在培养基中添加质量浓度为0.25 g·mL-1的蔗糖使变形链球菌形成生物被膜,药物处理24 h后结果如图2所示.与对照组相比,5 mg·mL-1的乙醇馏分以及3 mg·mL-1的乙酸乙酯馏分对变形链球菌生物被膜的形成表现出了显著的抑制活性,大约减少了相对85%的生物被膜形成(P<0.01).粗提物的抑制作用稍弱,8 mg·mL-1时生物被膜的形成相对减少了约70%(P<0.01).

(a) 粗提物质量浓度对生物被膜形成的影响(b) 乙醇质量浓度对生物被膜形成的影响(c) 乙酸乙酯质量浓度对生物被膜形成的影响

2.3 甘草提取物的不同馏分对变形链球菌产酸性的影响

甘草提取物的不同馏分对变形链球菌产酸性的影响如图3所示. 对照组的pH值从开始的7.1下降至最终的4.1, 而药物处理组的pH值变化明显减弱,4.00 mg·mL-1的粗提物、2.50 mg·mL-1的乙醇馏分以及1.50 mg·mL-1的乙酸乙酯馏分在处理12 h后的最终pH值仍然在6.0左右. 同时2.00 mg·mL-1的粗提物、1.25 mg·mL-1的乙醇馏分以及0.75 mg·mL-1的乙酸乙酯馏分在处理4 h后也保持着6.0左右的pH值, 尽管在处理12 h后, 它们的最终pH值与对照组相比几乎没有差别.

(a) 粗提物质量浓度对产酸性的影响(b) 乙醇质量浓度对产酸性的影响(c) 乙酸乙酯质量浓度对产酸性的影响

3 讨 论

尽管人们对口腔健康越来越重视,但龋齿的患病率仍然以惊人的速度上升[10].变形链球菌在龋齿发病机理中的作用已有充分文献记载.变形链球菌的主要致龋特性是其能形成生物被膜以及通过糖酵解途径产生有机酸[11].因此,能够有效地控制变形链球菌生物被膜的形成以及有机酸产生的新型抗龋药物是研究人员关注的重点.

牙菌斑生物被膜是一种能够黏附在有机或无机材料表面的致龋性微生物群落[12].生物被膜中的细菌通常被包裹在胞外聚合物基质中(由多糖、蛋白质以及胞外DNA组成),与浮游细菌相比,生物被膜对抗菌药物,宿主免疫防御机制和恶劣的外部环境都具有很强的抵抗力,这也使得龋病的预防和治疗变得更加困难[4].在本研究中,甘草提取物的不同馏分都对变形链球菌生物被膜的形成表现出了不同程度的抑制作用.综合来看,乙酸乙酯馏分所需的质量浓度最低,抑制效果略强于乙醇馏分,而粗提物的抑制活性相较于二者则明显下降.大量研究表明,许多黄酮类化合物对口腔细菌,特别是变形链球菌表现出了良好的抗菌活性,例如Liu等[13]发现芹菜素可以通过增加细菌的表面疏水性从而抑制生物被膜的形成.甘草中也含有大量的黄酮类化合物,推测乙酸乙酯馏分中某些极性偏小的黄酮苷元可能是其抑制作用较强的主要原因.对甘草提取物各级馏分中所含主要活性成分的分离和鉴定是未来研究的主要方向之一.

致龋细菌产生的有机酸也是导致龋齿形成的主要原因之一[14].变形链球菌能够黏附在牙齿的硬组织上,通过分解食物中的碳水化合物产生有机酸,从而使牙釉质脱矿并形成龋齿[15].在本研究中,甘草提取物的不同馏分处理后,pH值的变化与对照组相比都有所减小,粗提物、乙醇馏分以及乙酸乙酯馏分对变形链球菌产酸性的抑制作用效果相当.

目前天然产物在龋病防治方面仍面临着许多不可忽视的挑战.尽管目前的提取分离技术已经比较成熟,但是从复杂天然产物中提纯各种有效成分依旧非常困难.甘草提取物中单个分子对变形链球菌生物被膜形成的影响及其相关机制需要进一步研究.此外,口腔中没有特异的致龋菌,用一种特殊细菌来解释龋病的发生是不可能的.未来我们将使用多菌株生物被膜模型来尽可能地模拟真实口腔内各种细菌间的生态关系.