烟草黑胫病不同菌株对不同药剂的抗性评价

杨应美,卢灿华,盖晓彤,姜 宁,陈齐斌,苏家恩,吴德喜*,夏振远*

(1.云南农业大学 植物保护学院,云南 昆明 650201;2.云南省烟草农业科学研究院,云南 玉溪 653100;3.云南省烟草公司 大理州公司,云南 文山 671000)

烟草黑胫病(Tobacco black shank)是由烟草疫霉菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)引起的根茎类病害[1],在我国各大烟区都有发生,每年造成的损失达数亿元[2],是制约我国烟草优质安全生产的重要因素[3]。因此,必须重视对烟草黑胫病的防控。烟草黑胫病的防治措施包括农业防治、种植抗病品种[4]、化学防治[5]和生物防治[6]等,其中化学防治是最有效的方法[7]。而化学杀菌剂是防治烟草黑胫病的主要药剂,目前登记在册可以防治疫霉类的杀菌剂主要有苯胺类、羧酸酰胺类、丙烯酸酯类、烷基盐酸盐类、恶唑类、氨基酸类等,常用药剂为嘧菌酯、烯酰吗啉、氟啶胺以及甲霜灵等[8-9]。但化学药剂的滥用及对病原菌的高度选择性,致使高抗药性病原菌不断产生,从而使这些常规药剂对烟草黑胫病的防治效果下降,不能满足生产需求[6]。例如,Yang T等[10]发现已有烟草黑胫病菌株对甲霜灵产生抗药性。王革等[12]曾在1997年对烟草疫霉对甲霜灵的敏感性进行了研究,在云南烟区未发现对甲霜灵产生抗性的菌株。但甲霜灵在烟草上应用已超过30年,烟草疫霉抗性菌株已在美国、西班牙和南非陆续出现[13-14],我国也有烟草疫霉菌对甲霜灵产生抗药性的报道[15]。同时有研究[16]表明,泸州烟区已经有中抗甲霜灵和烯酰吗啉的菌株的出现,说明这两种药剂均存在一定的抗性风险。在法国已经检测到葡萄霜霉病菌对烯酰吗啉产生抗性的菌株,证实了烯酰吗啉存在抗性风险[10]。上述前人的研究结果表明在农业生产上无形中加大了化学药剂的使用量,而烟草作为叶用作物,对烟草过量施用农药不仅会影响其品质,还会严重危害人体的健康,影响农业可持续发展。因此,迫切需要开发有效、安全和环保的杀菌剂替代当前常规药剂。

烯酰吗啉、氟吗·乙铝、霜霉威、噁霉·稻瘟灵这4种药剂是目前登记防治烟草黑胫病的农药产品,而福美异菌脲、菌核净·锰锌、春雷霉素、腈菌唑、三唑酮、甲基硫菌灵、多菌灵这7种药剂用于防治烟草黑胫病的应用还没有取得正式登记[17]。本研究采用菌丝生长速率法测定了2019年从云南不同地区采集的烟草黑胫病菌菌株对上述11种药剂的抗药性,以期为云南烟草疫霉菌的防治和抗性治理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

2019年从云南省主要烟区采集具有典型症状的27份烟草黑胫病病株,在实验室进行分离鉴定，得到烟草疫霉菌27株用于实验。其中,来自红河(HH)的菌株有5株,来自昆明(KM)的菌株有3株,来自临沧(LC)的菌株有8株,来自曲靖(QJ)的菌株有4株,来自文山(WS)的菌株有7株。

1.2 供试药剂及药剂工作浓度

供试药剂有11种,参照产品推进使用浓度制定测试工作浓度如下:50%烯酰吗啉可湿性粉剂(T1)0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L;50%福美异菌脲可湿性粉剂(T2)0、0.13、0.25、0.5、1、2、4 mg/L;50%氟吗·乙铝可湿性粉剂(T3)0、0.5、1、2、4、8、16 mg/L;55%菌核净·锰锌可湿性粉剂(T4)0、0.63、1.25、2.5、5 、10、15 mg/L;4%春雷霉素可湿性粉剂(T5)0、0.5、1.0、2.0、4.0、5、8 mg/L;12.5%腈菌唑可湿性乳剂(T6)0、0.5、1、2、4、8、16 mg/L;15%三唑酮可湿性粉剂(T7)0、0.5、1、2、4、8 mg/L;20%噁霉·稻瘟灵液剂(T8)0、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0 mg/L;70%甲基硫菌灵可湿性粉剂(T9)0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg/L;50%多菌灵可湿性粉剂(T10)0、0.02、0.03、0.06、0.13、0.25、1 mg/L;72.2%霜霉威水剂(T11)0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/L。

1.3 烟草疫霉菌对11种药剂的抗性测定

先将供试药剂用丙酮或无菌水配成有效浓度为1%或10%(w/v)的母液,置于4 ℃冰箱中备用。在测定时,根据含药浓度与培养基的用量,用移液器吸取一定量的药剂母液稀释液加入熔化并冷却至60 ℃的培养基中,充分摇匀后制板,每皿25 mL。在燕麦琼脂平板上培养(26 ℃,黑暗)3～4 d的参试菌株菌落边缘打出直径7 mm菌饼,将菌饼接种到不同浓度梯度含药平板中央,菌丝面朝下,每平板接种1块,每种浓度1个处理,每个处理3次重复,放置在28 ℃恒温培养箱中黑暗培养5 d。用十字交叉法测量各供试药剂不同浓度处理的菌落生长直径(mm),取平均值后计算抑制率，计算公式为:抑制率(%) =(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-7)×100。

根据生物统计机率换算表[18],将抑制百分率转换成抑制机率值,并将浓度值转换成对数值,以浓度的对数为横坐标,以抑制机率为纵坐标,绘制杀菌剂的回归曲线,并求出不同杀菌剂对病菌的毒力回归直线方程、抑制中浓度EC50及相关系数(r)[19，20]。

1.4 烟草疫霉菌对药剂的抗性水平分析

参考兰波等[21]对抗性指数的计算方法计算抗性指数,划分出敏感性菌株和抗性菌株,并对抗性菌株频率进行计算,确定抗性水平和抗性菌株频率。抗性指数的计算公式为:抗性指数=参试菌株的EC50/敏感基线EC50。菌株抗性水平的划分标准如下：敏感菌株，抗性指数≤1;低抗菌株，1<抗性指数≤3;中抗菌株，3<抗性指数≤10;高抗菌株，抗性水平>10。抗性菌株频率的计算公式如下:抗性菌株频率(%)=(抗性菌株/供试菌株)×100。

2 结果与分析

2.1 烟草疫霉菌对11种药剂的抗性测定结果

依据测定的菌丝生长数据并按照1.3节的方法计算得到表1,数据显示:11种药剂对27株不同菌株均有一定的抑制作用,由强到弱依次为:50%烯酰吗啉、50%福美异菌脲、50%氟吗·乙铝、55%菌核净·锰锌、4%春雷霉素、12.5%腈菌唑、15%三唑酮、20%噁霉·稻瘟灵、70%甲基硫菌灵、50%多菌灵、72.2%霜霉威。说明这11种药剂均可作为防治烟草黑胫病的初选药剂,其中烯酰吗啉对烟草疫霉菌的抑制效果最好,福美异菌脲次之,而霜霉威的抑制效果最差。

表1 烟草疫霉菌对11种药剂的抗性测定结果

2.2 烟草疫霉菌对11种药剂的抗性水平分析

根据生物测定数据并按照1.4节的方法计算抗性频率和抗性水平，结果(表2)表明:对烯酰吗啉敏感的菌株有16株,占59.26%；低抗菌株10株,占37.37%；中抗菌株1株,占3.70%；无高抗菌株；抗性菌株11株,抗性频率为40.74%。对福美异菌脲低抗的菌株有11株,占40.74%；中抗菌株16株,占59.26%；无敏感和高抗菌株；抗性菌株27株,抗性频率为100%。对其余9种药剂来说，均为高抗菌株,抗性频率均为100%。说明云南烟草疫霉菌已对氟吗·乙铝、菌核净·锰锌、春雷霉素、腈菌唑、三唑酮、噁霉·稻瘟灵、甲基硫菌灵、多菌灵和霜霉威产生了高度抗性,对福美异菌脲产生了中度抗性。

2.3 抗药性水平在地区之间的差异分析

分析云南各地的抗药性情况,结果(表2)显示：5个不同烟区菌株对烯酰吗啉的抗性频率由大到小依次为:文山(57.14%)、红河(40.00%)、临沧(37.50%)、昆明(33.33%)和曲靖(25.00%),除了文山有1株中抗菌株外,其余地区的菌株均为敏感和低抗菌株;5个不同烟区菌株对福美异菌脲的抗性频率均为100%,但没有出现高抗菌株,均为低抗和中抗菌株;5个不同烟区菌株对其余9种药剂的抗性频率均为100%,且均为高抗菌株。说明在云南文山、红河、临沧、昆明和曲靖5个地区施用氟吗·乙铝、菌核净·锰锌、春雷霉素、腈菌唑、三唑酮、噁霉·稻瘟灵、甲基硫菌灵、多菌灵和霜霉威防控烟草疫霉菌的效果不佳,施用福美异菌脲的效果也不理想,施用烯酰吗啉可能有一定的效果,但文山地区的烟草疫霉菌对烯酰吗啉的抗性频率比其它4个地区均要高一些。

表2 烟草疫霉菌对11种药剂的抗性分析结果

2.4 烟草疫霉菌对11种杀菌剂抗药性的表现型

根据供试的27个烟草黑胫病菌菌株对11种药剂的抗、感性程度,可以分为2种表现型：T1RT2RT3RT4RT5RT6RT7RT8RT9RT10RT11R(对11种药剂均表现抗性)、T1ST2RT3RT4RT5RT6RT7RT8RT9RT10RT11R(对烯酰吗啉表现敏感,对其余10种药剂表现抗性),其中第一种表现型有11株,所占比例为40.7%,第二种表现型有16株,所占比例为59.3%。在2种抗药性表现类型中,对福美异菌脲、氟吗·乙铝、菌核净·锰锌、春雷霉素、腈菌唑、三唑酮、噁霉·稻瘟灵、甲基硫菌灵、多菌灵和霜霉威这10种药剂均表现为抗性,说明不同地区在防治烟草黑胫病时,连续施用这10种药剂会产生抗药性,因此,不宜连续施用这10种药剂防控云南烟草疫霉菌。烯酰吗啉对烟草疫霉菌的防控效果较好,可以与生产上其他药剂或生防菌混用或轮用。

3 结论与讨论

本研究结果表明：对烯酰吗啉而言，云南省烟草疫霉菌以敏感菌株较多(占59.26%),为优势群体,而低抗菌株较少(37.37%),中抗菌株最少(3.70%),未出现高度抗性的菌群,抗性菌株11株,抗性频率为40.74%;对福美异菌脲来说，云南省烟草疫霉菌以中抗菌株较多(59.26%),低抗菌株次之(40.74%),无高抗菌株,抗性菌株27株,抗性频率为100%;对其余9种药剂而言，云南省烟草疫霉菌均为高抗菌株,抗性频率均为100%。说明云南省烟草疫霉菌对烯酰吗啉没有产生明显的抗性,烯酰吗啉对云南的烟草疫霉菌仍有很好的抑制作用,仍是防治烟草黑胫病的理想药剂;对福美异菌脲产生了中度抗性,福美异菌脲用于防治云南烟草黑胫病效果不理想;对其余9种药剂产生了高度抗性,这9种药剂在防治云南烟草黑胫病中已经没有使用价值。

值得注意的是:(1)文山地区烟草疫霉菌对烯酰吗啉的抗性频率略高于其它4个地区的,而5个不同烟区菌株对其余10种药剂的抗性频率均相同(100%)。这可能与文山地区的用药历史和用药水平有关,可能文山地区烟农存在用药不规范的情况,如:单一使用药剂,随意增加用药量,滥用或乱用药剂等。(2)国内其它省份以及国外曾报道过烟草疫霉菌对烯酰吗啉产生了抗药性，例如：战徊旭等[11]报道泸州烟区已经有烯酰吗啉的中抗菌株的出现,说明施用烯酰吗啉存在一定的抗性风险；在法国已经检测到葡萄霜霉病菌对烯酰吗啉的抗性菌株,证实了烯酰吗啉存在抗性风险[10]。因此,今后在防控云南文山以及其他同类烟区的烟草黑胫病时应坚持烯酰吗啉与其它药剂或生防菌科学混用或轮用,或使用新药剂,以延缓病菌产生抗药性,有效提高防病效果。