阴虚体质中lncRNA和mRNA表达谱分析及调控网络研究

董丽丹 李玲孺 李博怿 严云 郑燕飞 王琦

摘要 目的：體质在疾病的形成、发展和转归中起着重要作用。本研究从转录组学水平首次初步揭示阴虚体质者外周血中lncRNA和mRNA的表达谱及相关作用网络。方法：运用Agilent Human lncRNA+mRNA（4×180 k）表达谱芯片，从阴虚体质（n=10）和平和体质（n=9）者的外周血中分离单个核细胞（PBMCs），采用“limma”方法筛选2组的差异基因，然后对其进行GO功能和IPA通路的显著性富集分析，并寻找lncRNA近距离调控的靶基因。结果：差异表达的lncRNAs和mRNAs均能够将阴虚体质和平和体质进行区分。阴虚体质中有显著差异表达的lncRNAs 829个（282个上调，547个下调）和mRNAs 1 435个（1 038个上调，397个下调）。GO功能富集和IPA作用通路结果提示，这些差异表达基因主要与免疫调节、代谢紊乱和信号传导失常通路显著相关。例如，T细胞受体信号转导，NF-κB信号通路，L-arabinose代谢过程和I型糖尿病信号传导等。确定了7个lncRNA-mRNA相互作用对，比如，LTA-HCP5、ORAI3-AC135048.13和BCL7C-AC135048.13等。结论：阴虚体质易感干眼症、高血压、糖尿病等疾病的物质基础可能与lncRNAs/mRNAs的免疫调节、代谢作用和信号传导失常相关。

关键词 长链非编码RNA;阴虚体质;生物信息学;中医

Analyses of Long non-coding RNA and mRNA Expression Profiles and Research on the Regulatory Network in Subjects with the Yin Deficiency Constitution

DONG Lidan，LI Lingru，LI Boyi，YAN Yun，ZHENG Yanfei，WANG Qi

（National Institute of Traditional Chinese Medicine Constitution and Preventive Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：Constitution in Traditional Chinese Medicine（TCM）plays an important role in the initiation，development，and prognosis of diseases.We aim to identify a previously unexplored lncRNA and mRNA expression signatures and lncRNA-mRNA regulatory networks in the Yin Deficiency Constitution（YDC）from the transcriptome.Methods：lncRNA+mRNA Human Gene Expression Microarray V4.0（4×180 K）was performed in this study.The Peripheral Blood Mononuclear Cells（PBMCs）were isolated from the subjects with YDC（n=10）and Balanced Constitution（BC）（n=9）.The “limma” method was performed between groups of significantly differentially expressed lncRNAs and mRNAs，The regulated lncRNA target genes were investigated by bioinformatics techinques， including Gene Ontology （GO） and Ingenuity Pathway Analysis（IPA）.Results：The differential expression lncRNAs/mRNAs could be used to distinguish individuals with YDC from those with BC.These were 829 DElncRNAs（282 up-regulated，547 down-regulated）and 1435 mRNAs（1 038 up-regulated and 397 down-regulated）in the YDC.GO enrichment analysis and IPA functional indicated that these differentially expressed genes were associated with Immune regulation，metabolic disorders and signal transduction disorders.For example，T cell receptor signaling，NF-κB signaling pathway，L-Arabinose metabolic processes，and type 1 diabetes signaling and so on.Seven most significant interaction pairs of lncRNA-nearby targeted mRNAs were identified including LTA-HCP5，ORAI3-AC135048.13 and BCL7C-AC135048.13.Conclusion：This study revealed that lncRNAs/mRNAs could be used as potential biomarkers in the YDC，and the material basis of YDC susceptibility to xerophthalmia，hypertension，diabetes mellitus might contribute to immunity and hormone regulation.

Keywords lncRNAs; Yin deficiency constitution; Bioinformatics; Chinese medicine

中图分类号：R21文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.01.024

阴虚体质（Yin Deficiency Constitution，YDC）是九种中医体质之一，是由于体内津液精血等阴液亏少，以阴虚内热等表现为主要特征的体质状态，以体形瘦长、性情急躁，面色潮红，手足心热，口渴喜冷饮等为主要表现，与健康人有别且易患糖尿病，高血压，干眼症等疾病[1-2]。前期开展了YDC流行病学调查、基因组学、代谢组学和蛋白组学研究，证实其确实是一个独特的群体，且有免疫失调、代谢紊乱和信号传导失常倾向，但长链非编码RNA（Long Non-coding RNA，lncRNA）对该体质表型特征有哪些调节作用，目前尚不清楚[3-6]。

lncRNA是一类转录本长度超过200 nt的非编码RNA分子，它们通过多种机制广泛参与生物体多种生理或病理过程，例如，染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程[7-8]。随着研究的不断深入，越来越多的证据表明，lncRNA功能障碍与多种疾病高度相关（例如，糖尿病、高血压、便秘、干眼症等疾病）并扮演至关重要的作用[9]，那么YDC是否有独特的lncRNA表达特征？其临床特征和疾病易感性是否受lncRNA调控呢？

因此，本研究运用Limma方法对10例YDC和9例平和体质（Balanced Constitution，BC）者的外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs）lncRNA+mRNA表达谱芯片数据进行差异分析，找到了YDC与BC差异表达的lncRNA（比如HCP5、AC135048.13和RP11-321E2.3等），发现其所调控的mRNA主要富集到免疫调节、代谢紊乱和信号传导失常等相关通路，说明YDC具有免疫失调、代谢紊乱和信号传导失常方面的潜在风险，且这种临床特征受lncRNA调控。通过寻求YDC者的敏感标志物，为YDC者易感疾病的预防和治疗提供新思路。

综上所述，本研究为lncRNA在YDC免疫失调、代谢紊乱和信号传导失常方面的调控作用提供了证据，并锁定了YDC一些关键的具有cis-调控作用的lncRNAs，为今后从lncRNA角度开展相关研究奠定了基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究于2014年3月从北京弘医堂中医医院体检中心体质门诊人群中，筛选出19例符合中医体质判定标准的志愿者，其中YDC 10例与BC 9例。入组病例年龄分布在20岁至55岁不等，获得所有参与者的书面知情同意。本研究方案经北京中医药大学伦理委员会批准（伦理审批号：2012BZHYLL0301），并符合赫尔辛基宣言。

1.2 纳入标准 1）年龄18～65岁北京市自然人群，无明确的疾病诊断;2）依据中华中医药学会2009年4月批准的《中医体质分类与判定》标准[10]，符合YDC及BC判断标准者;3）签署知情同意书。

1.3 排除标准 1）研究对象为一般人群，不符合诊断标准或纳入标准者;2）兼夹体质者;3）已明确诊断患有某种慢病者;4）妊娠期或哺乳期妇女。

1.4 中医体质分型标准 本课题按照中华中医药学会2009年颁布的《中医体质与分类判定》标准进行体质分型（编号：ZZYXH/T157-2009），患者体质分型的采集方式主要为当面随访：本研究在随访前应告知志愿者及其家属本次体质分型调查的意义并取得知情同意，随访时让患者在规定时间内完成《中医体质分类与判定》标准调查问卷[10]。随访结束后，分别统计每种体质类型得分，再依据转化分计算公式算出各类型体质的转化分（分数区间在0～100分），根据转化分进行最终体质类型的判定。计算公式为：转化分=（总分-条目数）×100/（条目数×4）。

1.5 研究方法

1.5.1 外周血单核细胞（PBMCs）的分离 临床采样前，经专业培训的医务工作者应告知受试者本研究的实验目的、研究意义及相关注意事项，并签署知情同意书。嘱咐采血前1 d应禁酒和劳累，女性避开月经期，志愿者早晨应空腹，由医院专职医务人员用含EDTA的采血管抽取6 mL静脉血，并于4 h内分离出PBMCs。

1.5.2 总RNA抽提 本研究使用淋巴细胞分离液（Solarbi，中国，货号：p8610-200ml），采用密度梯度离心法分离PBMCs，用TRIzol試剂（Invitrogen，美国，货号：15596-026）以避免RNA降解，然后于-80 ℃进行保存。按照厂家说明书提取总RNA。使用分光光度计（Thermo Scientific，美国，型号：NanoDrop 2000）测定RNA浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳进行RNA完整性分析。

1.5.3 芯片数据分析 本研究在技术上是采用双通道进行的。将总RNA与lncRNA+mRNA人基因表达芯片V4.0（4×180 k）进行杂交（CapitalBio，Inc.）。利用CapitalBio的cRNA扩增和标记试剂盒中改良的Eberwine线性RNA扩增方法和酶促反应，可提高荧光染料（Cy3-dCTP和Cy5-dCTP）标记的cDNA的产量。采用了安捷伦科技公司的Feature Extraction软件（Version10.7.1.1）从微阵列图像中生成原始数据。使用Agilent公司的GeneSpring软件（V13.0）对mRNA和lncRNA数据进行质量控制、归一化分析。运用R软件中的“limma”方法找到差异表达的lncRNAs（DElncRNAs）和mRNAs（DEmRNAs）。差异基因筛选参数设置为P<0.05和|Fold change|≥1.5时差异有统计学意义。

1.5.4 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，并使用R 3.3.1软件和Cytoscape 3.7.2进行绘图。计数资料例数用“%”表示，计量资料用均数±标准差（±s）表示，使用R软件的“limma”软件包，运用T检验或Mann-Whitney U检验对归一化数据组进行统计分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA和mRNA表达谱的分布特征 为了确定转录组特征及哪些lncRNA或mRNA可用于区分YDC和BC，对19例受试者的lncRNA和mRNA表达谱进行微阵列分析。2组研究对象的年龄（P=0.70）、性别（P=0.74）、体质量指数（BMI）（P=0.82）差异均无统计学意义。见表1。本研究对这些样本血液中的总RNA进行提取和纯化，并进行微阵列分析，箱线图见图1。可见芯片数据分布对称性和完整性较好。表1概述了入组者的主要临床特征。根据|Fold change|≥1.5和P<0.05共鉴定出829个差异lncRNAs（282个上调，547个下调）和1 435个差异mRNAs（1 038个上调，397个下调），如火山图2A、B所示，可见差异表达的lncRNAs和mRNAs分布较均匀，提示芯片结果较好。

2.2 YDC的聚类分析 YDC与BC对比，以|Fold change|≥1.5，且P<0.05为标准，共筛选出2 264个差异基因（829个差异lncRNAs和1 435个差异mRNAs），然后对其进行无监督聚类分析，热图结果见图2C和D所示。使用DElncRNAs，见图2C或DEmRNAs，见图2D时的样本分组与其表达值基本一致，可见2组样本清晰地聚集为两类，显示差异表达的lncRNAs和mRNAs能够较好地区分YDC和BC，说明YDC和BC存在着系统性的lncRNAs和mRNAs表达差异。

2.3 lncRNA-mRNA的调控关系 为了探讨哪些关键mRNAs受lncRNAs所调控，本研究以|Pearson correlation coefficient|>0.7，且P<0.05为标准，通过构建lncRNA-mRNA共表达网络，YDC与BC共有差异lncRNAs 829个，其中与lncRNA显著相关上调的mRNAs 350个，下调的mRNAs 175个，从中选取P值最小的top100对儿lncRAN-mRNA构建共表达网络。见图3。其包含45个mRNAs和36个lncRNAs。

2.4 GO功能富集分析 对YDC差异表达lncRNAs靶向调控的mRNAs进行Gene Ontology（GO）功能富集分析。见图4。差异mRNAs在GO生物过程与YDC作用特点相关的条目主要富集在免疫调节、代谢紊乱和信号传导失常等相关通路。比如，细胞蛋白代谢过程，GTPase活性的正调控，peptidyl-tyrosine脱磷酸作用，L-arabinose代谢过程以及T细胞受体信号通路的正向调控等显著相关。

2.5 IPA通路分析 对YDC差异表达lncRNAs靶向调控的mRNAs分别进行Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析，lncRNAs靶向调控上调和下调的mRNAs主要与免疫调节，代谢调节和信号传导相关，如图5列出P值小于0.001的作用通路，例如，YDC主要与T细胞受体信号转导，NF-κB信号通路，I半乳糖降解I（Leloir途径），I型糖尿病信号传导，3-phosphoinositide生物合成，维甲酸介导的细胞凋亡信号以及促血小板生成素的信号传导等通路显著相关。

2.6 YDC的lncRNA靶基因预测 进一步联合lncRNA-mRNA共表达网络和lncRNA上下游300 kb范围锁定关键的lncRNA-mRNA基因对儿（同时满足lncRNA上下游300 kb，|PCC|>0.7），如BCL7C，LTA，ORAI3，PLAC8，FCGR1B，XLOC_004308，XLOC_004539等分别受AC135048.13，HCP5，RP11-219O3.2，RP11-439A17.10，RP11-321E2.3和RP11-1036E20.9等cis-调控。见图6。说明这些lncRNAs在YDC中具有cis-调控作用。

3 讨论

以往对YDC开展了流行病学调研，基因表达谱和蛋白质组学等相关研究，证实其确实是一个独特的群体，并有免疫失调、代谢紊乱和信号传导失常方面倾向[3-6，11]，但其与此密切相关的lncRNA作用研究尚不清楚。本研究运用生物信息学方法，对YDC与BC人群lncRNA+mRNA表达谱进行分析，發现通过差异lncRNA可将YDC与BC人群进行区分，且这些差异lncRNA（比如HCP5、AC135048.13和RP11-321E2.3等）所调控的mRNA（LTA、ORAI3和BCL7C等）主要富集到免疫和代谢调节相关通路。其对YDC在临床易感疾病方面具有潜在调控作用，为今后基于lncRNA层面开展YDC相关疾病防治研究打下良好的基础，以及对建立中医体质微观评价方法具有十分重要意义。

通过对芯片结果进行生物信息学分析发现，YDC主要富集到免疫失调、代谢紊乱和信号传导失常相关通路。本研究中YDC与BC差异表达的lncRNA所调控的mRNA主要与T细胞和B细胞免疫调控相关，见图4、5。文献研究证实Toll样受体和B细胞在自身免疫性疾病如类风湿性关节炎和干燥综合征等疾病的发病机制中起着关键作用[12]。B细胞的消耗会延迟新诊断的T1DM患者的疾病进程[13]。T细胞受体信号传导对血管生成、重塑和造血发育具有重要作用，与心血管疾病之间存在密切关系[14]。另外，L-arabinose代谢可促进高脂肪饮食的C57BL/6J小鼠肠道产生氢气并改善代谢综合征[15]。上述通路和基因在本研究中均显著表达。本试验中显著上调的基因有RAP1B、TRAF3、MAP3K1和NFKB1等。

此外，信号传导调节的作用。TNFR1信号传导影响胰高血糖素样肽-1的表达和分泌，与2型糖尿病的发病机制有关[16]。维甲酸受体介导的信号传导保护心肌细胞免受高血糖诱导的细胞凋亡：肾素-血管紧张素系统的作用，表明其在高血糖介导的细胞凋亡和视黄酸受体成分的表达中具有重要作用[17]。RhoA信号通路在糖尿病视网膜病变微血管内皮功能障碍中具有重要作用[18]。G蛋白信号传导调节剂5（RGS5）调节G蛋白偶联的受体信号传导，是血压稳态的关键调节器，对诸如高血压的血管病变具有重要的临床意义[19]。这些通路中显著上调的基因涉及PRKCB、CASP8和TIRAP等。另外，有关lncRNA具体的作用机制有待进一步深入研究。本研究也具有一定的局限性，样本量较少及缺乏系统的试验验证。

综上所述，本研究首次从lncRNA角度对YDC的微观物质基础进行了剖析，结合lncRNA-mRNA共表达网络及lncRNAs 300 kb范围内的mRNAs综合分析，初步找到一些具有cis-调控作用的lncRNAs，为YDC在lncRNA层面可分提供了证据，为其易感疾病相关性提供微观科学依据，并为中医体质客观可分、微观基础研究创新了思路。

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（2020-12-02收稿 責任编辑：王明）

基金项目：中国博士后基金项目（2018M641283），中央高校基本科研业务费专项资金特色学科专项：中医体质学（2019-JYB-TSXK-001）

作者简介：董丽丹（1987.09─），女，博士，助理研究员，研究方向：中医体质微观基础研究，E-mail：dld888@163.com

通信作者：王琦（1943.02─），男，硕士，教授，博士研究生导师，中国工程院院士，研究方向：中医体质学，E-mail：wangqi710@126.com

;郑燕飞（1984.01─），男，博士，副研究员，研究方向：中医体质学，E-mail：yanfei_z@163.com