生酮饮食对小鼠骨骼肌力量及运动耐力的影响

袁瑞 李帆 胡桂霖 孙晓明 舒秋嫒 李卓群 弓浩宇 胡浩

1 西安交通大学医学部2016级侯宗濂实验班（西安710061）2 西安交通大学医学部基础医学实验教学中心（西安710061）

1921年Wilder首先提出“生酮饮食”(高脂肪、低碳水化合物饮食)用以治疗儿童难治性癫痫[1]。20 世纪70年代，由于这种饮食方法减少体重而被广泛知晓，其中最为著名的就是“阿特金斯饮食法”，其控制体重的有效性已被大量研究所证实[2，3]。近些年来，生酮饮食被广泛应用于涉及体重级别的体育运动项目(如柔道、摔跤等)，许多运动员希望能通过这种饮食方法在短时间内迅速减轻体重，从而获得更好的运动成绩。有研究显示[4，5]，一段时间的生酮饮食能够改变机体利用能量的方式，从以利用碳水化合物为中心转变为利用脂肪产能为主，即“脂肪适应”。但有多项人体干预实验显示，受试者在接受生酮饮食后出现体能下降、疲劳等不良症状[4，5]。生酮饮食作为一种特殊的饮食模式，是否会影响机体骨骼肌力量及运动耐力，目前仍没有明确的研究报道。本研究分别以生酮饲料和标准饲料喂养小鼠4 周，观察并测定小鼠运动耐力以及腓肠肌力量，以探究生酮饮食对骨骼肌力量及运动耐力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性ICR小鼠20只，体重18～22 g，购于西安交通大学实验动物中心。生酮饲料(D12358)购于北京博泰宏达生物有限公司，标准饲料(D12450B)购于西安交通大学实验动物中心。血酮仪购于美国雅培公司，血糖仪购于三诺生物传感股份有限公司，BL-420F生物信号采集与处理系统购于成都泰盟软件有限公司，BCA蛋白定量试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司。

表1 生酮饲料与标准饲料的营养成分

1.2 动物分组及喂养

适应性喂养1 周后，小鼠随机分为标准饮食(standard diet，SD)组和生酮饮食(ketogenic diet，KD)组，每组10 只。所有动物单笼喂养，自由饮水，每天记录体重和进食量。SD 组动物自由进食标准饲料，KD 组根据SD 组前24 h 内进食量的平均值给予等能量的生酮饲料，共喂养4周。

1.3 血糖和血酮的测定

生酮饮食4 周后，小鼠尾静脉采血，检测血糖、血酮水平。负重游泳前以及负重游泳后3 min 内检测小鼠血糖、血酮水平。

1.4 负重游泳实验

实验第4 周末，小鼠进行负重游泳实验。将均质铁环负于离鼠尾尖2 cm 处，有效负重为体重的10%(已扣除铁环产生的浮力)。将小鼠从离水面30 cm处，头朝下释放入水中，水深50 cm，水槽四壁光滑，水温控制在25℃± 1℃。观察小鼠游泳情况，记录小鼠从释放到沉入水中5 s内不能浮出水面的时间。

1.5 在体腓肠肌收缩实验

动物手术：动物饲养4 周后，待血糖、血酮测定及负重游泳实验结束后，次日对小鼠进行麻醉，俯卧位固定于手术板上，剃去后肢及躯干后背部的毛，剪开皮肤，游离右侧腓肠肌，跟腱处用手术线结扎后离断。分离坐骨神经并切断胫神经外的其他分支。将腓肠肌结扎线与张力换能器相连，并给予4 g前负荷。

单收缩和强直收缩最大收缩幅度：将刺激电极与坐骨神经干接触。选择刺激参数：波宽0.2 ms，延迟0.05 ms，从0.2 V开始寻找阈刺激强度，逐步增加刺激强度至引起单收缩最大幅度的最小刺激强度(Umin)。在2Umin(最小刺激强度的2倍)条件下观察并记录腓肠肌单收缩的最大收缩幅度。在2Umin的条件下，从30 Hz开始连续刺激，寻找引起完全强直收缩的最小频率，在最小频率下刺激坐骨神经，观察并记录肌肉完全强直收缩的最大收缩幅度。

连续串刺激至最大收缩幅度后下降至最大幅度50%所用时间(T50)：在2Umin的条件下，以2 Hz 的频率给予坐骨神经连续单刺激，观察并记录T50。

1.6 腓肠肌质量和总蛋白含量测定

在体腓肠肌收缩实验后处死小鼠，取右侧腓肠肌称重。准确称取0.02 g腓肠肌肌肉组织，加入300 μL裂解液，制成组织匀浆，12000 rpm/min，4℃下离心20 min，取上清液。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量。

1.7 统计学方法

采用SPSS19.0进行数据处理，实验结果以均数±标准误(Mean±SEM)表示。两组小鼠体重、血酮水平、血糖水平、负重游泳时间、腓肠肌单收缩和强直收缩的最大收缩幅度、腓肠肌质量和总蛋白含量的比较采用独立样本t检验。T50比较采用Mann-WhitneyU检验。负重游泳前后血糖、血酮水平比较采用配对样本t检验。检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 生酮饮食对小鼠体重的影响

实验过程中，两组小鼠对饲料的接受程度良好，未出现明显异常。小鼠体重变化趋势如表2所示，分组喂养前小鼠体重无显著性差异(t=0.438，P=0.667)，但从第3 周开始，生酮饮食组小鼠的体重显著低于标准饮食组(t=2.445，P=0.024＜0.05)。这提示在等能量饲养的情况下，生酮饮食可降低小鼠体重。

表2 两组小鼠体重比较(g)

2.2 生酮饮食对小鼠血糖和血酮水平的影响

如表3所示，分组喂养4 周后，两组小鼠的血糖水平无显著性差异(t=0.674，P=0.509)。而生酮饮食组的血酮水平显著高于标准饮食组(t=4.674，P=0.001＜0.05)，提示生酮饮食升高小鼠血酮水平，但对血糖水平无显著影响。

表3 两组小鼠血糖和血酮水平比较

2.3 生酮饮食对小鼠负重游泳时间的影响

如表4所示，两组小鼠负重游泳时间无显著差异(t=0.424，P=0.676＞0.05)，且表5显示，两组小鼠负重游泳前后，血糖水平均无显著变化(标准饮食组：t=1.071，P=0.312＞0.05；生酮饮食组：t=0.897，P=0.393＞0.05)，提示生酮饮食对小鼠的运动耐力无显著影响，运动前后血糖水平始终维持在相对稳定的状态。标准饮食组小鼠负重游泳后血酮水平高于游泳前(t=2.631，P=0.027＜0.05)，提示标准饮食组小鼠运动前酮体较少参与供能，运动促进了酮体的生成和机体对酮体的利用；而生酮饮食组负重游泳后血酮水平无明显变化(t=0.432，P=0.676＞0.05)，提示酮体可能在运动前后均为生酮饮食组小鼠的主要供能物质。以上结果说明生酮饮食改变了小鼠对能量物质的利用方式或代谢方式。

表4 两组小鼠负重游泳时间比较

表5 生酮饮食对小鼠负重游泳的影响

2.4 生酮饮食对小鼠在体腓肠肌收缩的影响

如表6所示，两组小鼠腓肠肌单收缩和强直收缩最大收缩幅度均无显著差异(单收缩：t=1.999，P=0.061＞0.05；强直收缩：t=1.141，P=0.269＞0.05)。两组小鼠腓肠肌连续串刺激的T50无显著性差异(Z=I0.529，P=0.597＞0.05)，提示生酮饮食对小鼠腓肠肌收缩无显著影响。

表6 两组小鼠在体腓肠肌收缩幅度及T50值比较

2.5 生酮饮食对小鼠腓肠肌质量和总蛋白含量的影响

由表7可知，两组小鼠腓肠肌质量和总蛋白含量均无显著性差异(质量：t=0.334，P=0.743；总蛋白含量：t=1.614，P=0.126＞0.05)，提示生酮饮食对小鼠腓肠肌质量和总蛋白含量无显著影响。

表7 两组小鼠腓肠肌质量和总蛋白含量比较

3 讨论

生酮饮食是指低碳水化合物且脂肪相对增加的饮食。已有大量研究显示，生酮饮食能够在为机体提供足够能量的前提下控制体重，因此生酮饮食在涉及体重级别的运动项目(如柔道、摔跤等)中可能具有一定的应用价值。但对于生酮饮食和运动之间关系的研究仍十分有限。本研究以小鼠为研究对象，经过4 周的分组喂养后，结果显示生酮饮食降低了小鼠体重，这与其他研究结果一致[6，7]。生酮饮食可使小鼠血液血酮水平增高，但血糖水平没有明显变化。这一结果提示，4周的低碳水化合物、高脂肪饮食不会对小鼠血糖造成影响，而作为供能物质的酮体增高是生酮饮食动物模型的主要表现之一[8]。酮体是脂肪酸在肝脏氧化的中间产物，血液酮体的变化可能会对机体能量代谢方式产生影响，有相关研究指出，正常饮食的小鼠运动后肝外组织器官对酮体的利用水平明显低于酮体的产生水平，因此会出现运动后血酮水平升高[9]。而在本研究中，标准饮食组小鼠游泳后的血酮水平显著高于游泳前，符合运动后血酮水平升高的情况，而生酮饮食组小鼠游泳前后的血酮水平并无显著性差异，说明4 周生酮饲料的喂养改变了生酮饮食组小鼠机体利用酮体的能力，即“脂肪适应”。

负重游泳是评价小鼠运动耐力的重要指标[10]，在本研究中，生酮饮食组和标准饮食组小鼠的负重游泳时间并无显著性差异，说明生酮饮食对运动耐力并无显著影响。小鼠在体实验中，连续串刺激诱发小鼠腓肠肌持续收缩，随着时间的推移，肌肉疲劳会导致收缩幅度逐渐下降，通过比较从肌肉最大收缩幅度到降至50%最大收缩幅度所用时间(T50)，可以看出两组小鼠的T50无明显差异，也同样说明生酮饮食对小鼠肌肉耐力没有明显影响。在负重游泳过程中，心脏功能起着重要作用，当心功能受损，如心衰发生时，心肌细胞供能会以脂肪酸为主转变为以葡萄糖为主[11]，属于心肌细胞代谢异常。研究显示[12]，生酮饮食可改变心肌细胞能量代谢方式，维持脂肪酸供能可以更好地保护心肌细胞。单收缩与强直收缩幅度能够反映骨骼肌力量的大小，而两组小鼠腓肠肌单收缩和强直收缩的最大收缩幅度均无显著性差异，说明生酮饮食对骨骼肌力量无显著性影响。生酮饮食小鼠运动耐力及骨骼肌力量的相对稳定，可能与血糖的相对稳定以及酮体代谢利用的改变有关。有研究报道[13]，生酮饮食增强了小鼠脂肪的运输与代谢能力，其运动能力不会减弱。此外，生酮饮食诱导的酮体升高可上调骨骼肌细胞线粒体多种蛋白的表达，增加线粒体生物活性，这些均与维持运动能力的稳定有关。本研究中所使用的生酮饲料蛋白含量低于普通饲料，在等能量喂养的基础上，生酮饮食组小鼠的进食量为标准饮食组小鼠的60%左右，因此生酮饮食组小鼠的蛋白摄入量远低于标准饮食组，但两组小鼠的腓肠肌质量和总蛋白含量均无显著性差异，说明低蛋白含量的生酮饮食并不会导致骨骼肌质量和总蛋白含量降低。研究显示，大量酮体的产生能够抑制糖异生，从而减少了肌肉中蛋白质的分解[14，15]，这也是生酮饮食小鼠运动能力保持不变的可能原因。

4 结论

本研究结果表明：(1)为期4周的生酮饮食降低小鼠体重，升高血酮水平，该饮食模式增加了生酮饮食小鼠在运动过程中对酮体的利用，但对血糖水平无明显影响；(2)生酮饮食对小鼠的负重游泳时间、T50时间、腓肠肌单收缩和强直收缩最大幅度以及腓肠肌重量和蛋白含量均没有显著影响，该饮食模式不会影响小鼠的运动耐力和肌肉收缩力。

本研究为生酮饮食减轻体重、保持肌肉力量与运动能力的饮食模式提供了参考依据，但更长期的生酮饮食是否会对骨骼肌力量等方面造成影响仍有待进一步研究。