跑轮预运动通过抑制纹状体脑区儿茶酚胺类物质丢失改善血管性痴呆大鼠认知功能

张琳琳 范永召 顾瑞亭 刘燕中 吴昊 刘一平

1 运动与健康福建省高等学校重点实验室，福建师范大学体育与科学学院（福州350007）2 国家体育总局运动能力评价与研究综合重点实验室，北京市运动机能评定与技术分析重点实验室，首都体育学院运动与健康学院（北京100191）3 郑州市经济技术开发区行知小学（郑州450016）

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是痴呆中常见的类型之一，是由一系列脑血管因素导致脑组织损伤而引起的智能损害综合征[1]。血管性痴呆患者早期主要表现为健忘，且常常被人们所忽视，认为只是衰老过程的正常表现；中期主要表现为健忘加重、理解困难、睡眠紊乱等；晚期主要表现为严重的认知功能障碍，且活动受限，几乎完全依赖他人，并可能伴随着许多并发症，如抑郁、焦虑等，这将会持续加重痴呆症状[2-4]。活体层次研究[5-6]表明血管性痴呆可引起脑部神经元异常死亡，从而导致其认知功能下降。已有研究表明[9]通过对血管性痴呆大鼠进行白藜芦醇药物干预，可有效改善其认知功能，但血管性痴呆大鼠对药物呈剂量依赖性。有文献表明[7-8]适量的运动训练可显著改善血管性痴呆后的认知功能，但其内在机制仍需进一步研究。神经生物学研究表明：适量运动可促进血管再生和脑血液供应，提高脑的抗氧化能力[9-10]。认知神经科学研究亦证实：跑台、游泳等预运动可提高神经突触的可塑性，改善相关脑区的神经再生能力[11-12]。纹状体是基底神经节的重要核团之一，被视为基底神经节接收和整合信息的“门户”，它不仅接受皮层、丘脑、黑质等多个神经元的投射和中间神经元的调节，还受到许多重要的神经递质或/和调质的调控，如儿茶酚胺类物质。这一系列信号在纹状体处整合后，通过直接通路纹状体黑质神经元和间接通路纹状体苍白球神经元发出投射，最终通过2 条通路的平衡完成对运动的精确调控[13-14]。基于上述研究背景，本研究采用被动回避反射实验评价大鼠的认知功能，并利用活体脑内微透析技术和高效液相色谱技术，观察跑轮预运动对血管性痴呆大鼠纹状体脑区儿茶酚胺类物质的影响，为运动改善血管性痴呆后认知功能的病理生理研究提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验对象与方法

1.1.1 实验动物与分组

选取32 只健康3月龄雄性SD 大鼠，体重250～350 g，由北京市北京大学第三医院实验动物中心提供。动物实验已通过动物伦理委员会的批准。将大鼠随机分为假手术组(C 组，n＝8)、痴呆组(VD 组，n＝8)、运动1周痴呆组(1w-Exe+VD组，n＝8)、运动4周痴呆组(4w-Exe+VD 组，n＝8)。1w-Exe+VD 组和4w-Exe+VD 组大鼠分别接受为期1 周、4 周的跑轮预运动后通过双侧颈总动脉结扎手术模拟血管性痴呆大鼠模型；VD组大鼠只接受双侧颈总动脉结扎手术模拟血管性痴呆大鼠模型；C组大鼠仅暴露双侧颈总动脉，不进行结扎处理。

1.1.2 跑轮运动

将跑轮预运动作为大鼠运动训练的方法[15]。1w-Exe+VD 组和4w-Exe+VD 组大鼠分别在主动跑轮(美国Harvard公司)里单笼自由养1周和4周，并且能够在主动跑轮上正常自由运动。跑轮正下方的电磁计数器记录大鼠运动圈数，每天运动距离=3.14×跑轮直径×圈数。VD组和C组大鼠则在正常鼠笼里面自由饲养，且无任何运动干预。

1.1.3 血管性痴呆模型的制备

采用双侧颈总动脉结扎手术模拟血管性痴呆模型[16]。大鼠在造模前禁食12 h，禁水4 h。大鼠经腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后呈仰卧位；消毒后于颈正中切口，用手术镊钝性分离双侧颈总动脉，并使用医用棉线进行结扎；术后缝合伤口，放回笼中饲养。1 周后，根据“Zea-Longa 5 分制评分法”对大鼠进行造模评判[17]：无功能性损伤为0 分；前爪不能完全伸展为1分；身体向一侧转动为2分；行走向一侧倾倒为3分；不能自发行走，并且丧失意识为4 分；死亡为5 分。评分标准在1～4分之间即为造模成功。

1.2 认知功能的评定

造模成功后采用被动回避反射来评价各组大鼠的认知功能。被动回避反射实验分为训练阶段和重复训练阶段。在训练阶段，将大鼠放于左侧明室中，让大鼠在明室自由活动。120 s 之后，打开明暗室间隔，记录大鼠从明暗室间隔打开到大鼠完全进入暗室的时间，作为“潜伏期Ⅰ”。当大鼠完全进入暗室后，关闭明暗室间隔，打开电刺激控制器，让处于暗室中的大鼠足部受到来自底板通电栅条的电刺激，持续时间10 s。电刺激结束后，打开明暗室间隔，大鼠回到明室中。重复训练阶段，也就是初次训练24 h 后，大鼠将被再一次放入穿梭箱内自由活动30 s，然后缓慢打开明暗室间隔，观察并记录此时大鼠进入暗室的时间间隔，作为“潜伏期Ⅱ”。重复训练阶段不再给予电刺激。如果大鼠在300 s之后仍旧停留在明室一侧而没有进入暗室，说明大鼠已完全记住在初次训练阶段给予的电刺激，也就是说不存在认知功能障碍，则记录该大鼠的“潜伏期Ⅱ”为300 s。反之，如果大鼠在300 s 之内进入暗室，说明大鼠已忘记在初次训练阶段给予的电刺激，也就是说存在认知功能障碍，则将此时间作为大鼠的“潜伏期Ⅱ”。

1.3 纹状体脑区儿茶酚胺类物质的测定

采用微透析-高效液相色谱法检测纹状体脑区儿茶酚胺类物质-多巴胺(dopamine，DA)、去甲肾上腺素(noradrenaline，NE)、肾上腺素(epinephrine，E)的含量。首先大鼠经腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后，采用脑立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)固定大鼠头部；切开颅顶皮肤，暴露前囟点，结合大鼠脑立体定位图谱将套管种于纹状体脑区，坐标为：AP = 0 mm，L =－3.0 mm，V =－4.5 mm[18]。接下来，将微透析探针通过套管插入到纹状体脑区。微透析泵将人工脑脊液经微透析探针以2 μL / min 流速持续灌流90 min，待脑组织周围透析液达到平衡稳定后开始收集透析液。最后将所收集到的透析液放入高效液相色仪器的进样器中检测多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素物质的含量。

1.4 免疫荧光观察纹状体脑区神经元数目

大鼠灌流取脑后，将整个脑组织经4% 多聚甲醛固定后放于30%的蔗糖PBS 溶液中脱水，再经乙醇脱水和二甲苯固定后进行石蜡包埋，放入含有包埋剂的锡箔纸杯中。将脑组织采用冰冻切片机切片后，选择一张约10μm 厚度的切片贴于Fisher 正电防脱载玻片上，65 ℃烤15～30 min，－20 ℃保存。从－20 ℃冰箱中取出切片。室温封闭1～2 h 后将一抗神经元特异性核蛋白(NeuN)(稀释倍数为1︰100)加在切片上，4 ℃孵育16～24 h[19]。将湿盒从4 ℃层析柜中拿出，切片放入装有0.01 M PBS 的盒子中洗6 次，每次5 min。加入适量荧光二抗，室温孵育1～2 h；将切片放入装有0.01 M PBS的盒子中洗6次，每次5 min，抗荧光衰减封片剂封片。各组大鼠经NeuN 免疫荧光染色后，在高倍镜视野(× 400)显微镜下观察纹状体背侧区域，并进行拍照计数。本实验中，先利用荧光显微镜先找到纹状体脑区后放大200倍，在此基础上再放大200倍后观察纹状体脑区神经元，以保证各组观察到的纹状体脑区保持一致。

1.5 统计学分析

采用GraphPad Prism 5软件对相关数据进行整理和分析。所有数据均用平均数±标准差(±s)表示。两组间的比较采用独立样本t检验，多组间的比较采用单因素方差分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠主动跑轮运动

如图1所示，运动1周痴呆组和运动4周痴呆组大鼠每天运动量分别为948.61 ± 162.61 m、878.73 ±203.65 m。与前人报道结果保持一致[20]。以上数据说明，本实验中运动1周痴呆组和运动4周痴呆组大鼠运动干预成功。

图1 大鼠在主动跑轮里的运动量

2.2 双侧颈总动脉结扎诱导血管性痴呆模型可靠性评价

对双侧颈总动脉结扎1周后大鼠的存活率进行统计，并根据“Zea-Longa 5 分制评分法”对本实验中的血管性痴呆大鼠进行神经功能缺损评分(表1)后，得出：假手术组存活8 只，死亡0 只；血管性痴呆组存活6只，死亡2只；运动1周痴呆组大鼠存活8只，死亡0只；运动4周痴呆组大鼠存活7只，死亡1只。结扎1周后，假手术组大鼠精神状态良好、饮水饮食正常，无神经功能损伤特征；血管性痴呆组大鼠总体精神萎靡不振，饮水饮食减少，活动能力降低，反应迟钝，存在典型神经功能缺损特征；运动1周痴呆组和运动4周痴呆组大鼠精神状态较血管性痴呆组稍有所缓解。评分在1～4分之间即为血管性痴呆造模成功。以上数据说明本实验中造模成功。

表1 神经功能缺损评分

2.3 跑轮预运动对血管性痴呆大鼠认知功能的影响

如图2所示，在初次训练的学习阶段，假手术组、痴呆组、运动1 周痴呆组、运动4 周痴呆组大鼠的潜伏期Ⅰ分别是71.33 ± 5.80 s、68.67 ± 6.34 s、72.16 ±18.70 s、70.27± 9.10 s。在重复训练阶段，假手术组、痴呆组、运动1 周痴呆组、运动4 周痴呆组大鼠的潜伏期Ⅱ分别是300 s、72.11 ± 16.70 s、300 s、300 s。本实验结果表明：4 组大鼠潜伏期Ⅰ之间无显著性差异(P＞0.05)；与假手术组相比，痴呆组大鼠潜伏期Ⅱ显著降低(P＜0.001)；与痴呆组相比，运动1 周痴呆组、运动4周痴呆组大鼠潜伏期Ⅱ显著升高(P＜0.001)；且运动1周组与运动4周组大鼠间无显著性差异(P＞0.05)。

图2 4组大鼠在两个阶段的潜伏期

2.4 跑轮预运动对血管性痴呆大鼠纹状体脑区多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素的影响

图3显示了4 组大鼠纹状体脑区儿茶酚胺类物质水平变化，结果如下：与假手术组相比，痴呆组大鼠纹状体脑区多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素的水平显著下降(P＜0.001)；与痴呆组相比，运动1 周痴呆组、运动4 周痴呆组大鼠纹状体脑区多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素的水平显著升高(P＜0.01)；且运动1周组和运动4周组大鼠间无显著性差异(P＞0.05)。

2.5 跑轮预运动对血管性痴呆大鼠纹状体脑区神经元的影响

由NeuN免疫荧光图(图4)可见：与假手术组相比，血管性痴呆组大鼠纹状体脑区神经元数目明显减少；与血管性痴呆组相比，运动1周痴呆组和运动4周痴呆组大鼠纹状体脑区神经元数目明显增加；且运动1 周组和运动4周组大鼠间无明显差异。

图4 各组大鼠纹状体脑区NeuN免疫荧光染色结果

3 讨论

血管性痴呆是仅次于阿尔兹海默症的第二大常见痴呆类型，其危害主要表现为认知功能障碍[21]。Bagcı等[22]通过被动回避反射实验来评价血管性痴呆大鼠的认知功能，研究表明血管性痴呆大鼠的认知功能显著下降。与前人研究结果一致，本实验研究结果也表明血管性痴呆后认知功能下降。Brown 等[23]研究发现血管性痴呆后其认知功能下降与脑部微血管的损伤、丢失有关。本研究发现血管性痴呆后认知功能下降与纹状体脑区儿茶酚胺类物质水平下降有关。纹状体是基底神经节中信息传导的主要核团之一，主要接受来自皮层的大量神经投射，直接或间接参与随意运动的程序编制与执行[24-25]。这表明纹状体在对运动的调控方面发挥着重要作用。不仅如此，纹状体在运动促进认知功能方面也有着不可替代的作用。活体研究表明运动可通过调节纹状体脑区多巴胺[26]、去甲肾上腺素[27]、肾上腺素[28]等神经递质的水平，来改善该脑区的信息传递和认知功能。神经病理学研究表明纹状体儿茶酚胺类物质异常与疾病的发生密不可分[29-30]。本研究发现血管性痴呆后纹状体脑区儿茶酚胺类物质(多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素)水平下降。有文献表明[31-32]纹状体脑区去甲肾上腺水平的下降将可能与其合成场所(神经元)的减少有关。而本实验通过免疫组织化学实验也证明血管性痴呆后其纹状体脑区神经元数目明显减少，损伤程度明显增加。由此可见，血管性痴呆后认知功能下降可能与神经元数目的减少导致纹状体脑区儿茶酚胺类物质的合成减少有关。

因此，寻找到一种切实有效的方法改善血管性痴呆后的认知功能十分重要。分子学研究[33-35]表明：运动可促进脑部细胞的可塑性和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的水平，从而改善其认知功能。据文献报道[36]：跑轮运动是一种主动的、自发的运动，可根据大鼠自身的生活习惯与特点来进行运动干预，因而对大鼠的认知功能具有更好的促进作用。Islam 系统总结了主动跑轮运动可从减小脑部神经炎症、增加神经再生能力、提高突触可塑性等方面来提高大鼠的认知功能[37]。此外，范永召探讨了短期运动(1周主动跑轮运动干预)和长期运动(4周主动跑轮运动干预)对大鼠认知功能的影响[38]。尽管短期运动和长期运动均可以改善血管性痴呆大鼠的认知功能[39-40]，然而不同运动干预时间对改善血管性痴呆大鼠的认知功能的效果及相关机制是否存在差异仍需进一步探讨。本研究将为期1 周和4 周的跑轮预运动作为血管性痴呆大鼠的预运动训练方式。本研究还通过被动回避反射实验评价大鼠认知功能，结果表明运动1 周组和运动4 周组大鼠的认知功能显著优于痴呆组。本研究结果表明：1周和4周的跑轮预运动均可显著改善血管性痴呆后的认知功能。已有研究[41]表明运动可通过NF-κB/miR-503/BDNF通路改善血管性痴呆大鼠的认知功能。分子生物学研究[40-44]表明运动可通过激活多巴胺能、去甲肾上腺素能系统来改善认知功能。本研究从分子水平证实运动1 周组和运动4 周组大鼠纹状体脑区儿茶酚胺类物质水平显著高于痴呆组，表明1周和4周的跑轮预运动也可通过提高血管性痴呆后纹状体脑区儿茶酚胺类物质含量来改善其认知功能。Hasegawa采用超高效液相色谱技术表明跑台运动可以增加正常状态下儿茶酚胺类物质的含量[45]。此外，本研究从细胞水平通过免疫荧光实验显示，与痴呆组相比，运动1周痴呆组和运动4周痴呆组大鼠纹状体脑区的神经元显著增加，表明为期4周和1周的跑轮预运动提高血管性痴呆后纹状体脑区儿茶酚胺类物含量，与其抑制血管性痴呆后大鼠纹状体脑区神经元的丢失有关。李雪课题组研究表明运动可抑制脑疾病状态下(如衰老)脑部神经元丢失和修复神经元形态结构来改善脑功能[46]。综上可见，为期1周和4周的跑轮预运动可通过抑制血管性痴呆大鼠纹状体脑区儿茶酚胺类物质的丢失和神经元数目的减少，从而改善其认知功能。

值得一提的是，为期1周和4周的主动跑轮预运动在行为学、分子水平、细胞水平均无显著性差异，推测其可能与短期运动就可以达到儿茶酚胺类物质变化的阈值有关。但其是否在其他方面存在显著性差异仍需进一步深入探讨。

4 结论

跑轮预运动干预通过抑制血管性痴呆大鼠纹状体脑区儿茶酚胺类物质的丢失和神经元数目的减少，从而改善其认知功能。