以β淀粉样蛋白作为阿尔茨海默症治疗靶点的研究进展*

郭一博 石镜明 刘 航 李岩松 孙正启

（西藏民族大学医学部神经疾病阿尔茨海默症的发病机制及藏药干预研究团队，咸阳 712082）

阿尔茨海默症（Alzheimer's disease，AD）是一种典型的神经退行性疾病，其主要病理特征是β淀粉样蛋白（amyloid beta peptide，Aβ）在神经元胞外聚集形成淀粉样斑，tau蛋白在胞内过度磷酸化产生神经纤维化缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）[1]。AD主要包括两种类型：家族遗传性阿尔茨海默症（familial Alzheimer's disease，FAD） 和散发性阿尔茨海默症（sporadic Alzheimer's disease，SAD）。FAD主要由早老素1（presenilin，PS1）、PS2和APP基因变异所致，SAD原因多样，尚不能确定病因[2]。目前AD发病机制尚未明确，也未找到准确的早期诊断标准以及有效的治疗方法，但以β淀粉样蛋白异常聚集导致神经细胞功能受损的淀粉样级联假说占据主导地位[3]。

研究表明，在AD症状出现的前15～20年，Aβ已经在患者脑内聚集并伴随着认知能力的下降[4]。从去世患者脑内的老年斑中可以提取大量的Aβ蛋白，这种蛋白来源于β淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）。APP是一种I型跨膜单链糖蛋白，在脑组织中有2条经典代谢途径。APP在人体中广泛存在，在促进神经细胞增殖分化、促进突触形成、生长和牵引等方面发挥重要作用[5]。

正常情况下，APP仅产生具有营养细胞作用的可溶性片段，但当APP基因发生突变时，β分泌酶和γ分泌酶裂解APP可能性增加，并释放出以Aβ40和Aβ42为主要形式的Aβ肽段，这些肽段能自发聚集形成各种聚集体，其中，Aβ42较Aβ40更容易聚集，这些可溶性的聚集体在脑内被小胶质细胞吞噬，并释入炎症因子损伤脑神经元，产生慢性神经退行性病变，最终导致AD的发生[6]。现有的AD药物不能有效地调节发病机制或延缓疾病的进展，尽管如此，人们并没有放弃此类药物的研发，例如：代谢APP和Aβ肽的分泌酶，因其具有良好的治疗潜力而备受关注；在复杂疾病的多药治疗中，开始考虑多靶点分泌酶调节剂；分泌酶相关的靶向药物的发现也充满挑战性等[7]。现分析近年来关于APP代谢及其代谢产物Aβ作为药物靶点治疗AD的研究，研究结果将为该领域内寻求Aβ相关药物提供一定的参考。

1 APP结构

APP是I型跨膜蛋白，含有19个外显子，分子量110～130 kD，有365～770个氨基酸，其编码基因位于人21号染色体长臂中段[8]。它类似于一种细胞表面受体，由一个较大的N端胞外区、跨膜区和一个较小的C端胞内区组成。APP分子从N端到C端，总体上可以划分为3个高度保守的区域：E1区域、E2区域和C端区域（图1）[9]。人体APP主要有3种亚型：APP695、APP751和APP770。其中APP695和APP751可以称为类淀粉样前体蛋白质 （amyloid precursorlike proteins，APLPs），又可以分别称为类淀粉样前体蛋白1（APLP1）和APLP2[8]。不同亚型的APP在体内分布不同。APP770包含全部外显子，在不同的组织细胞中都有表达；APP751仅缺少第8号外显子，在T淋巴细胞中含量丰富；而APP695缺少第7号和第8号外显子，主要存在于神经组织中[9]。当神经元分化时，APP695呈爆发式表达，而在脑损伤后，含Kunitz 型蛋白酶抑制剂（Kunitz-type protease inhibitor，KPI）结构域的APP751和APP770含量在小胶质细胞和星形胶质细胞中充分增加[10]。虽然APP、APLP1、APLP2在氨基端和羧基端的序列结构很相似，但Aβ序列只存在于APP中，而不存在于APLPs中。因此，相似的结构使APLPs成为研究APP时最常用的对照蛋白[9-10]。

图1 淀粉样前体蛋白（APP）主要3 种亚型[10]

APP的1～8号氨基酸是信号肽（signal peptide，SP）序列，可以在编码APP的基因翻译后，将APP蛋白导入内质网中，APP进入内质网后会产生蛋白折叠、磷酸化和糖基化等，同时也是其进入细胞膜转运系统的关键步骤。缺失SP后，尽管APP可以在细胞内表达，但是其向细胞外的分泌会受到影响[11]。

E1区域（氨基酸序列：28～190）包括一个肝素结合结构域（heparin-binding domain，HBD1），又名类生长因子结构域（growth factor-like domain，GFLD）和一个铜结合结构域（copper-binding domain，CuBD）[9]。HBD1结构域包括反向平行β折叠片、α螺旋和2条短的β折叠片，并由3对二硫键交错连接[10]。CuBD结构域是由3条反平行β折叠片、α螺旋和另外3对二硫键连接组成。这2个结构域之间由连接序列（Gly120-Leu132）连接，它虽然没有二级结构，却能像绳子一样连接着这2个结构域[12]。

E1和E2区域之间是一个高度酸性的区域（acidic domain，AcD），在体外很容易被降解，其中大部分氨基酸为Asp和Glu，使它难以形成有序折叠的结构，只能在E1和E2之间起连接作用[13]。在APP751中，酸性区域与E2区域之间存在一个KPI结构域；在APP770中，酸性区域与E2区域之间存在KPI和Ox-2抗原结构域[10]。KPI结构域是56个氨基酸组成的Kunitz型蛋白酶抑制剂。它由单一第7号外显子编码，而且仅存在于非神经元的APP种类中。KPI结构域可以折叠成独立单元，拥有KPI结构域的APP是低密度脂蛋白受体相关蛋白（low-density lipoprotein receptor-related protein，LRP）的配体，它可以与其相互作用而被内吞。在APP770中，KPI结构域邻近的一小段是Ox-2抗原结构域，由19个氨基酸组成，它与其他蛋白质没有显著的同源性[13]。

E2区域又称为APP中心结构域（central APP domain，CAPPD），是能够独立折叠的区域，由6个α螺旋形成2个超螺旋结构，是一个相对简单的蛋白质超二级结构[13]。包含一个促胸腺生成素序列（RERMS）和一个高亲和力的肝素结合结构域（HBD2）[10，13]。E2结构域中的RERMS具有生长因子的作用。与HBD1相比，HBD2具有更长的形状，似乎更有利于紧密结合肝素[13]。

C端区域包括跨膜结构域（transmembrane domain，TMD）和胞内结构域（APP intracellular domain，AICD）[10]。TMD螺旋高度弯曲，弯曲顶点近Gly708-709，约在脂质体中心位置处，Gly708赋予TMD高度柔韧性，使其能很好适应γ分泌酶加工方式。AICD是APP被γ分泌酶切割释放的胞内片段，共49～50个氨基酸。AICD释放到胞质中可能发挥细胞核信号转导功能[13]。

2 APP代谢过程

APP的代谢由α分泌酶、β分泌酶和γ分泌酶这3种水解酶介导。α分泌酶或β分泌酶在胞外结构域对APP进行切割，释放出APP外结构域分泌的片段，这些片段可以被共同称为APPs（也称为sAPP片段），也可以分别称为sAPPα（soluble APP alpha protein）和sAPPβ（soluble APP beta protein）。这2个片段至少占大脑中APP的50%。β和γ分泌酶依次切割APP，并释放出具有神经毒性的Aβ。相反，α分泌酶在Aβ之间进行切割，阻止其产生。以是否会产生Aβ作为条件进行划分，产生了2种经典途径，分别称为非淀粉样肽源途径（图2a）和淀粉样肽源途径（图2b）[10]。

图2 2 种经典肽源途径

非淀粉样肽源途径：α分泌酶在APP胞外结构域K687和L688之间进行切割，水解产生氨基端可溶性的片段sAPPα和羧基端的C83，其中sAPPα对大脑具有保护作用；γ分泌酶继续切割C83，水解产生氨基端的P3和羧基端的AICD[12]。淀粉样肽源途径：β分泌酶在APP胞外结构域M671和D672之间进行特异性切割，水解产生氨基端的sAPPβ和羧基端的C99；γ分泌酶继续在V722和I712或A713和T714之间切割C99，水解产生氨基端的Aβ和羧基端的AICD，Aβ分泌到细胞外[14]。

3 APP代谢产物

3.1 非淀粉样肽源途径代谢产物

在α和γ分泌酶依次水解下，会产生sAPPα和P3肽。sAPPα包含E1区域、E2区域和一小部分C端区域。在sAPPα的4个肝素结合位点（heparin-binding sites，HBS）（96-110；131-166；316-346；382-447）中，96-110区域参与了神经突生长的调节。在包含RERMS序列的氨基酸残基319-335也参与了轴突的生长。并且sAPPα氨基酸残基18-350的结构与富含半胱氨酸的生长因子相似，这表明sAPPα在体内起着生长因子的作用[15]。在神经细胞方面，sAPPα能刺激胚胎脑神经干细胞的增殖。与Aβ对神经元的有害作用相反，sAPPα具有神经营养或突触可塑性增强特征[16]。P3是α分泌酶在Aβ上切割产生的一种非致病性的较短形式的Aβ，包括Aβ17-40片段或Aβ17-42片段，具有营养功能[17]。

3.2 淀粉样肽源途径代谢产物

sAPPβ在β分泌酶水解后释放，包含促进神经突起生长所需的结构域，除了最后16个C末端氨基酸外，与sAPPα具有相同的序列。与sAPPα相比，sAPPβ不参与长时程增强（long-term potentiation，LTP）。这表明，sAPPα蛋白的最后16个C末端氨基酸参与了神经保护和LTP。有研究证明，sAPPβ比sAPPα更有效地诱导人类胚胎干细胞神经的快速分化。sAPPβ对轴突延长和神经分化的影响表明，该蛋白本身不具有有害性。与sAPPα一样，sAPPβ以同样的效应刺激小胶质细胞，这种效应与氨基酸残基444上游的N端结构域有关，是2种sAPPs共同的[15]。

Aβ是由APP经β分泌酶和γ分泌酶的顺次切割产生，含39 ～43个氨基酸残基。主要有Aβ40和Aβ42两种肽，后者毒性最强[18]。

4 以代谢产物Aβ为靶点的治疗

淀粉样级联假说认为，Aβ寡聚可以产生毒性，最终导致神经组织受损，继而发生疾病。因此，抑制Aβ寡聚物形成，或促进Aβ寡聚物解聚，是目前很多公司开发AD治疗药物的主要策略。

4.1 抗Aβ主动免疫疗法

主动免疫是指将外源性Aβ作为抗原，刺激机体产生相应抗体，抗体再与内源性Aβ结合形成抗原抗体复合物，最终被吞噬细胞清除[19]。

Elan公司生产的AN-1792疫苗显著减少了AD患者大脑中Aβ的沉积，但其诱导了T细胞介导的免疫应答，导致约6%的治疗患者发展为脑膜炎。目前，该项目已经终止[20]。

CAD106也是一种主动免疫疫苗，是由来自Aβ氨基端的Aβ1-6片段的多个拷贝组成，并与佐剂载体（Qβ病毒样颗粒）结合。CAD106产生的抗体可以与Aβ单体和寡聚物反应，阻断细胞培养中的Aβ毒性。其目的是避免激活炎症性T细胞，同时引发强烈的抗体反应。在2个APP转基因小鼠系中，CAD106在没有增加微出血或炎症反应的情况下减少了脑Aβ的积累[21]。目前，CAD106正在一项为期5年的双盲安慰剂对照Ⅱ/Ⅲ期研究（S1代）中进行预防性研究，该研究招募1 340名认知健康的纯合APOE*ε4携带者。该试验将测量MCI或AD痴呆延迟诊断的能力以及评估AD预防倡议综合认知（the Alzheimer's Prevention Initiative Composite Cognitive，APCC）测试分数的变化。这项研究预计将于2024年5月完成[22]。

4.2 抗Aβ被动免疫疗法

被动免疫是指将单克隆或多克隆人源化抗Aβ抗体注入体内，与内源性Aβ结合，直接诱导Aβ寡聚体分解或被吞噬细胞清除。目前正在开发5种抗体用于早期AD患者、FAD临床前阶段的患者和有AD高风险的无症状患者[19]。

Solanezumab是一种人源化IgG1单克隆抗体，靶向Aβ（Aβ13-28）的中心区域。识别可溶性单体Aβ，也可以与Aβ斑块结合。Solanezumab通过结合血液和大脑中的可溶性Aβ蛋白，促使Aβ蛋白在形成不可溶性的寡聚体和淀粉样斑之前被清除[19]。目前，该疫苗在1 150名无症状或轻度症状的老年人身上进行一项为期3年的双盲安慰剂对照研究，观察认知综合量表（the Alzheimer's Disease Cooperative Study–Preclinical Alzheimer Cognitive Composite，ADCS-PACC）上的表现，预计将于2022年完成[23]。此外Solanezumab、Gantenerumab和β分泌酶抑制剂Atabecestat共同参与438名无症状或轻度症状的APP、PSEN1或PSEN2常染色体显性突变携带者中进行的DIAN-TU试验，以测试它们在阻止或延缓认知缺陷方面的作用，该研究将于2023年完成[19]。

Gantenerumab是一种与Aβ的氨基末端和中心区域结合的全人重组单克隆IgG1抗体。对Aβ寡聚物和Aβ纤维的亲和力高，对单体Aβ的亲和力较低[24]。此药物虽未能穿过血脑屏障，但在较高剂量下具有可接受的安全性。除了参与上述Solanezumab、Atabecestat共同进行的DIAN-TU研究。还对早期AD和脑Aβ沉积的患者，采用未公开的高剂量，进行2年双盲安慰剂对照的临床Ⅲ期试验（GRADUATE 1 and GRADUATE 2），预计2023年完成[19]。

Crenezumab是一种人源化抗Aβ单克隆IgG4抗体，对Aβ聚集的五聚低聚物和16 mer纤维组合特别具有亲和力，也能阻止Aβ聚集，并促进其分解[25]。目前针对813例前驱至轻度AD并有脑淀粉样病变的患者进行为期100周、双盲、安慰剂对照的第Ⅲ阶段研究（CREAD），本研究的主要目的是观察2年内CDR-SB评分的变化，预计在2020年9月完成。另一项对750名前驱至轻度AD（CREAD2）患者进行相同剂量的双盲、安慰剂对照的Ⅲ期研究也在进行，该试验将于2021年11月完成。此外，Crenezumab正在一项双盲、安慰剂对照研究（API-ADAD）中对252名常染色体显性遗传PSEN1中Glu280Ala突变的前症状携带者进行预防性治疗，该试验应于2022年3月完成[19]。

Aducanumab是一种重组人IgG1抗体，识别Aβ序列的氨基末端残基3-7，与可溶性Aβ聚集体和不溶性纤维结合，在高剂量下，可与可溶性Aβ单体结合[26]。2项为期18个月、双盲、安慰剂对照的第Ⅲ期临床试验（ENGAGE和EMERGE）目前分别招收1 350名前驱性AD和阳性淀粉样PET扫描患者，按1：1：1的比例随机分配，接受低剂量Aducanumab、高剂量Aducanumab或安慰剂治疗18个月，并有可能接受24个月的长期延长治疗。主要观察CDR-SB评分从基线到第78周的变化，预计研究将于2022年12月完成[19]。

4.3 β分泌酶抑制剂

β分泌酶有很多种类，其中与Aβ生成密切相关的是天冬氨酸蛋白酶1（β-secretase 1，BACE1），BACE1介导的APP裂解是Aβ产生的第一步。许多研究表明，抑制蛋白酶BACE1的表达，可以有效减少脑内Aβ的生成或降低体内Aβ水平。但目前很少有BACE抑制剂处于第Ⅲ期临床开发，因为其中有些对人类有毒性而被抛弃[19]。

Verubecestat是一种口服BACE1抑制剂，对BACE1具有纳米亲合性，但对BACE2不具有纳米亲合性[27]。EPOCH试验对1 958例轻中度AD患者进行了为期78周的双盲安慰剂对照Ⅱ/Ⅲ期研究，评估了每天12、40 mg和60 mg Verubecestat的安全性和有效性。但是没有预先筛选存在脑淀粉样蛋白的患者，这项研究在预定完成前5个月因无效而终止[28]。在另一项为期104周的双盲安慰剂对照研究（APECS）中，对1 500名患有前驱性AD或轻度认知功能障碍（mild cognitive impairment，MCI）的患者分别进行了每天12 mg和40 mg剂量的Verubecestat测试，这些患者的PET扫描呈阳性。由于不利的风险-效益比，该试验提前终止。可以表明用Verubecestat治疗后的患者会出现认知恶化[19]。

Lanabecestat是一种口服的长效BACE1抑制剂，在I期和Ⅱa阶段的研究中，Lanabecestat对脑脊液Aβ1-42产生长期和剂量依赖性的抑制作用[19]。一项为期2年、双盲、安慰剂对照的Ⅱ/Ⅲ期研究（AMARANTH）评估了2 202名轻度AD或MCI患者，但由于这项研究在完成后不能达到其主要终点，所以以无效告终[29]。

Elenbecestat是一种BACE1抑制剂，已被证明能降低大鼠、豚鼠和非人类灵长类动物大脑和脑脊液中的Aβ浓度。目前2项24个月、双盲、安慰剂对照的Ⅲ期研究（MISSION AD1和MISSION AD2）正在进行中。这2项研究都招募了1 330名有脑淀粉样病变的MCI或轻度AD患者，每天接受50 mg Elenbeestat或安慰剂，主要结果是CDR-SB评分。预计结果将于2021年3月公布[19]。

Atabecestat是一种非选择性口服BACE1抑制剂，剂量依赖性地降低大鼠和猴的脑脊液Aβ水平[19]。在对健康志愿者使用单次和多次递增Atabecestat剂量的2个I期研究中，观察到脑脊液Aβ1–40水平的剂量依赖性降低[30]。Atabecestat也在前述的DIAN-TU研究中进行了评估，目前尚不清楚该药物是否已从该研究中撤出[19]。

CNP520是一种口服、长效、选择性的BACE1抑制剂，具有良好的脑渗透性，可使大鼠脑内Aβ水平降低80%以上[19]。一项为期13周、双盲、安慰剂对照的Ⅱ期研究（S1代）评估了125名健康老年人服用不同剂量的CNP520与安慰剂的情况，研究将测试CNP520延迟诊断MCI的能力，并提高APCC测试分数。预计结果将在2024年9月公布。还有一项类似的5年、双盲、安慰剂对照、Ⅱ/Ⅲ期研究（S2代），招募2 000名60 ～75岁认知健康、纯合子或杂合子APOE*ε4携带者，主要结果是MCI的诊断和APCC测试分数。该研究应于2024年8月完成[31]。

综上所述，β淀粉样假说是AD中重要的假说之一，近年来以Aβ为药物靶点治疗AD的研究取得了较大进展，很多有潜力的药物已进入Ⅲ期临床试验。然而目前还没有临床试验能证明抗Aβ疗法的有效性，所以应该根据试验失败的原因如药物的安全性、血脑屏障通透性和患者的耐受性等方面去寻找相应的解决办法，更好地发挥人工抑制剂对毒性Aβ的抑制效果，为今后AD药物的研发提供参考和思路。而且AD是一种多因素参与的疾病，随着对AD发病机制的深入研究和各种药物的不断完善，相信可以找到未来防治AD的有效模式和药物，为AD患者带来希望。