有机凝胶剂12-羟基硬脂酸及热加工对凝胶化大豆油氧化的影响

罗 晶，颜梦婷，李培旭，张翠平，傅 红

（福州大学生物科学与工程学院，福建 福州 350108）

12-羟基硬脂酸（12-hydroxystearic acid，12-HSA）在油脂中因其凝胶剂量低[1]、相对无毒[2]和易获得，被认为是一种理想的低分子质量有机凝胶剂[3]，其凝胶化油脂已广泛应用于工业生产、医药和化妆品中[4-5]。2009年，为了在食品中降低由饱和脂肪及反式脂肪引起的健康隐患，12-HSA首次作为新型的结构化凝胶剂应用于如涂抹酱、巧克力糖果及保健食品的食用油脂体系[6-9]。研究表明12-HSA具有独特的纤维状晶体，常作为研究凝胶化油脂在不同环境下晶型变化的典型代表[10]，同时其还能减缓巧克力因油迁移引起的脂肪起霜[8]，控制部分食品基质中生物活性化合物的释放速率并提高生物利用度[9]，因此发展前景广阔。目前，对12-HSA的研究主要集中于其凝胶化油脂的机械性能及晶体结构等方面[11-12]，但不可忽略的是，抑制凝胶化油脂的氧化对保障油脂品质安全具有重要意义[13]。由于有机凝胶化食用油脂的研究起步较晚，目前对12-HSA的氧化议题尚鲜有具体的相关文献报道。

12-HSA是分子结构上含有一个12位羟基取代的十八碳脂肪酸。同其他脂肪酸相比，12-HSA羟基和羧基两种官能团的相互作用能够形成分子间氢键，有助于自组装成分子聚集态并形成晶体网络结构使液态油脂结构化，并促使其凝胶化油脂的效率加倍[14-15]。在氧化机理方面，已有研究发现含有一个羧基的硬脂酸能显著增加油脂的顶空耗氧量，有明显的促氧化作用[16]；同时，其他凝胶化油脂的氧化研究结果表明，固态凝胶结构能一定程度地减少氧气进入油相，从而减缓氧化的发生[17-18]。鉴于上述机理，同时考虑到凝胶剂官能团对油脂真实氧化指标的检测干扰[19]及其对氧化的潜在影响[20]，本研究围绕12-HSA凝胶剂对油脂热氧化的作用机理，讨论12-HSA凝胶剂对油脂氧化指标的影响；对比硬脂酸、硬脂醇和十八烷分子，探究12-HSA的羟基或羧基官能团对油脂氧化的作用；在此基础上通过室温及热加工时凝胶状态的不同，研究凝胶结构稳定性对油脂氧化的影响；并利用核磁共振氢谱（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）法对12-HSA凝胶化油脂的热氧化状态进行分析。以期为提高12-HSA凝胶化食用油脂的氧化品质和规模化应用提供理论和数据依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金龙鱼一级大豆油 上海嘉里特种油脂有限公司；12-HSA、硬脂酸（均为工业级） 阿拉丁试剂（上海）有限公司；硬脂醇、十八烷（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钾（分析纯） 西陇科技股份有限公司；氘代氯仿（光谱纯，含体积分数0.03%四甲基硅烷） 美国CIL公司。

1.2 仪器与设备

DYT-PC01电位滴定仪 中科谱创仪器有限公司；MCR302流变仪 奥地利安东帕有限公司；BK-POLR偏振光显微镜 重庆奥特光学仪器有限公司；Q2000差示扫描量热仪 美国TA公司；7890B气相色谱仪（配有7697A顶空进样器和CP7538毛细色谱柱） 美国Agilent有限公司；NMR波谱仪（氢谱，500 MHz） 德国布鲁克仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 凝胶化油脂制备与实验分组

选取大豆油作为基料油，称取一定质量的大豆油加热搅拌，温度升至61 ℃时分别添加相应质量的12-HSA、十八烷、硬脂醇和硬脂酸（溶剂为大豆油），继续加热搅拌至融化完全，加热总时长（包括升温时间）为7 min，制备完成后倒入样品瓶中储藏于25 ℃下冷却备用。空白组只含有大豆基料油，其余加热步骤相同。

第一组：分别将含有添加量0.2%（以大豆油质量计，下同）、0.4%、0.6%和0.8%的十八烷、12-HSA、硬脂醇及硬脂酸油脂产品（6 g，下同）的顶空瓶（规格为12 mL，下同）置于45 ℃下储存5 d，冷却至室温后测定其顶空耗氧量。

第二组：分别将含有添加量1%、2%、3%、4%和5%的12-HSA凝胶化油脂的顶空瓶置于25 ℃下储存15 d后，测定其顶空耗氧量、流变学特性、微观结构。

第三组：将含有添加量2%的12-HSA凝胶化油脂的顶空瓶分别置于30、60、90、120、150 ℃中加热2 h，冷却至室温后测定其顶空耗氧量。

第四组：将含有添加量2%的12-HSA凝胶化油脂置于70 ℃下避光储存35 d。在氧化0～6 d阶段每隔3 d取样，氧化6～35 d阶段，每天取样。每次均取20 g油样，进行氧化指标及1H-NMR测定。

1.3.2 凝胶化油脂氧化指标的测定

酸价的测定参照GB 5009.229—2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》；过氧化值的测定参照GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》；茴香胺值的测定参照GB/T 24304—2009《动植物油脂 茴香胺值的测定》；总氧化值（total oxidation value，TOTOX）为茴香胺值与4 倍过氧化值之和[21]。

1.3.3 顶空耗氧量的测定

采用7890B气相色谱仪（热导检测器）：检测器温度230 ℃；载气He，流速5 mL/min；进样口温度120 ℃；柱温25 ℃；尾吹气为He，流速为3 mL/min；分流比50∶1[17]。顶空瓶中的氧气剩余量会因油脂氧化而发生变化，顶空耗氧量根据公式（1）进行计算[22]。

1.3.4 流变性质的测定

采用MCR302流变仪测定流变性质，振荡频率为0.1～100 Hz，振荡应力为0.1%（线性黏弹区内），测定在25 ℃下添加量1%、2%、3%、4%和5% 12-HSA凝胶化油脂储能模量随振荡频率的变化[23]。

1.3.5 偏振光显微镜观察

将适量12-HSA凝胶化油脂样品置于载玻片上，盖上盖玻片轻压成透明薄片，用连接Canon数码相机的偏振光显微镜观察样品的结晶形态，放大倍数为100[12]。

1.3.6 差示扫描量热仪测定热稳定性

分别称取适量添加量2%的12-HSA凝胶化油脂样品置于坩埚内，压紧密封。采用程序控温，先以10 ℃/min的速率将样品从室温加热至150 ℃，再以20 ℃/min的速率降至室温，测定其热力学曲线[13]。

1.3.71H-NMR图谱的测定

将1 mL凝胶化油脂样品溶解于5 mL氘代氯仿（CDCl3）混匀后，取0.6 mL混合液装入核磁管中，在室温下平衡5 min进行测定。以四甲基硅烷（δ＝0）为内标，谱宽δ0～20、扫描次数16 次、脉冲间隔2 s、脉冲序列zg30，测定样品的1H-NMR图谱。利用Bruker TOPSPIN2.1软件对1H-NMR图谱进行基线校正与相位校正，然后进行后续积分处理[24]。

1.4 数据处理与分析

所有实验均重复测定3 次，采用Origin 2019软件作图，采用SPSS 19软件通过单因素方差分析和Tukey's多重比较分析样品之间的显著性差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 12-HSA凝胶剂对大豆油脂酸价的影响

12-HSA作为新型的食用油脂凝胶剂，其分子官能团可能参与油脂氧化指标检测过程中的滴定反应或比色反应，进而无法准确反映油脂的氧化状态。本研究在过氧化值、茴香胺值及丙二醛值的氧化指标测定中，未发现12-HSA凝胶剂能够参与或干扰上述指标的检测过程，且发现上述指标均与顶空耗氧量呈良好的正相关关系（数据未显示）。但是在酸价的测定中，发现油脂的实测酸价和凝胶化油脂中12-HSA的质量（大豆油质量（10 g）×添加量/%）呈正相关关系，具体如图1A所示。同时结果还表明，单独的12-HSA凝胶剂在滴定过程中消耗KOH滴定液（图1B），导致实测酸价比油脂中游离脂肪酸所反映的真实酸价更高。这是由于12-HSA含有能电离出氢离子的羧基或羟基，氢离子消耗了KOH滴定液。因此在测定12-HSA凝胶化油脂的游离脂肪酸真实酸价时，应扣除12-HSA凝胶剂对KOH滴定液的消耗[19]（公式（2））。

图1 12-HSA凝胶剂对大豆油脂酸价的影响Fig.1 Effect of 12-HSA on acid value of soybean oil

综上，大部分传统氧化测定方法只能研究氧化的部分产物，但是顶空耗氧法能动态地反映油脂氧化中氧气消耗的量，对氧化的评价更直观且更加准确[17-19]，因此本研究选用顶空耗氧法作为后续的氧化测定方法。

2.2 12-HSA官能团对大豆油脂氧化的影响

12-HSA是分子结构上含有12位羟基及头端羧基两种官能团的脂肪酸。同12-HSA相比，十八烷缺少了12位羟基和头端羧基，而硬脂醇及硬脂酸分别只含有这两个官能团中的羟基和羧基。

由图2可知，12-HSA、硬脂醇及硬脂酸对油脂均表现出促氧化作用，而十八烷油脂的顶空耗氧量与空白组无明显差异。表明羟基及羧基的存在均能促进油脂的氧化，且羟基与羧基单独作用下的促氧化作用要强于同时含有羟基与羧基的12-HSA。从官能团上看，硬脂醇的羟基和硬脂酸的羧酸均为疏油性基团，分子结构中端基的疏油基团与它们的亲油性烃尾组合，能增强分子的空气-油界面浓缩效应，并且因在空气-油界面聚集而加速氧的扩散速率[25]，同时吸引促进氧化的过渡金属[26]。另外，由于硬脂酸的亲水亲油平衡（hydrophile lipophilic balance，HLB）值大于硬脂醇，高HLB值具有更大的疏油性，导致硬脂酸更易向空气-油界面移动，通过其氢键作用使羧基相互靠近，界面排列更加紧密，因此比硬脂醇更易降低界面的表面张力并增加溶氧量[16]，导致其促进油脂氧化的效果更加明显。但是，12-HSA虽然同时具有羟基和羧基，其促氧化能力却不如硬脂酸和硬脂醇，这暗示羟基和羧基的位置对促氧化作用有较大影响。已有研究表明，线性的脂肪酸更容易进入空气-油脂界面[27]，和硬脂酸及硬脂醇的线性结构相比，12-HSA由于12位羟基的存在减弱了其分子结构的线性特征，同时，碳链中部的羟基通过相互作用形成的分子间氢键，不仅增加了分子聚集体积，而且使其在油相中的移动速率低于硬脂酸和硬脂醇；此外，氢键导致头端羧基的远离使12-HSA无法像硬脂酸和硬脂醇一样在空气-油脂界面紧密排列，溶氧能力降低；因此12-HSA促氧化作用弱于硬脂酸和硬脂醇。

图2 不同添加量的十八烷、12-HSA、硬脂醇和硬脂酸油脂产品在45 ℃下氧化5 d的顶空耗氧量Fig.2 Headspace oxygen consumption for different additions of octadecane, 12-HSA, stearyl alcohol and stearic acid oil products oxidized at 45 ℃ for 5 d

2.3 凝胶结构对12-HSA凝胶化油脂氧化状态的影响

室温25 ℃储藏条件下，12-HSA凝胶化油脂的流变学特性和微观结构如图3所示。当储能模量与振荡频率表现出无关性时，表明流体已经形成了稳定的凝胶网络结构[28]。由图3A可知，添加量1%的12-HSA凝胶化油脂在10－1～100Hz和10 Hz处的储能模量均表现出频率相关性，说明其并未形成稳定的凝胶结构。添加量2%以上的12-HSA凝胶化油脂的储能模量均表现出频率无关性，表明已经形成了稳定的凝胶网络结构。同时，图3B为25 ℃时偏振光显微镜观察的添加量2% 12-HSA凝胶化油脂的纤维状晶体结构，显示出其良好的束缚液态油脂的特性。结合图4的顶空耗氧量测定结果，发现不同添加量的12-HSA凝胶化油脂顶空耗氧量均显著高于空白组，但是12-HSA添加量2%～5%的凝胶化油脂顶空耗氧量无显著差异，这和图3的流变学性质具有一致性，说明此时形成的稳定凝胶化油脂网络结构抑制了分子流动性[29]，使凝胶内部形成致密的保护膜，阻碍氧气进入油相体系引发氧化。

图3 室温下12-HSA凝胶化油脂的流变学特性及微观结构Fig.3 Rheological properties and microstructure of 12-HSA-containing oleogels at room temperature

图4 不同添加量的12-HSA凝胶化油脂在25 ℃储存15 d后的顶空耗氧量Fig.4 Headspace oxygen consumption for oleogels with different additions of 12-HSA oxidized at 25 ℃ for 15 d

凝胶化油脂在不同的食品加工条件下需要经历不同的加热状态，加工温度会影响12-HSA凝胶化油脂的氧化程度。差示扫描量热仪分析结果显示，12-HSA的熔融温度为60.23 ℃。添加量2%的12-HSA凝胶化油脂热力学曲线如图5所示，49.56 ℃时12-HSA凝胶化油脂出现第一个吸热峰，此时油脂开始熔化；60 ℃时出现12-HSA的吸热峰，两处峰图重叠形成一个宽的熔融峰，表示凝胶结构逐渐被破坏。由图6可知，添加量2%的12-HSA凝胶化油脂与空白大豆基料油的氧化程度均随温度的升高而增大；当温度低于60 ℃时，12-HSA凝胶化油脂的氧化程度略低于大豆基料油，此时12-HSA凝胶化油脂仍处于凝胶状态，较低温度的短时间内凝胶网络能减缓油脂氧化；当温度大于60 ℃时，12-HSA凝胶化油脂的凝胶结构虽然开始被破坏，但由于12-HSA凝胶体系的黏度仍较大，分子向空气-油脂界面的移动受到限制[29]，促氧化作用不明显；当温度达到90 ℃时，12-HSA凝胶化油脂的顶空耗氧量相比空白大豆基料油增加了0.65%；随着温度继续上升，12-HSA油脂凝胶结构完全被破坏，样品黏度随温度的升高而降低[30]，导致氧化速率加快、促氧化作用明显；120 ℃时12-HSA凝胶化油脂的顶空耗氧量相比空白组增加了1.78%；随后顶空耗氧量急剧增加，150 ℃时12-HSA凝胶化油脂的顶空耗氧量比空白对照组增加了6.8%。以上结果提示，12-HSA凝胶化油脂食品的加工温度应尽量避免高于90 ℃，且120 ℃以上的高温将促使产品急剧氧化。

图5 添加量2%的12-HSA凝胶化大豆油脂热力学曲线Fig.5 Thermodynamic curve of 2% 12-HSA-containing oleogels

图6 添加量2%的12-HSA凝胶化大豆油脂在不同温度下氧化2 h后的顶空耗氧量Fig.6 Headspace oxygen consumption for 2% 12-HSA-containing oleogels oxidized at different temperatures for 2 h

2.4 12-HSA凝胶化油脂热氧化后的1H-NMR分析结果

将添加量2%的12-HSA凝胶化油脂置于70 ℃下35 d进行加速氧化实验，并根据油脂中H质子1H-NMR分析结果反映油脂的热氧化状态。如图7A所示，δ7.26处为氘代氯仿的溶剂峰，未经热氧化的12-HSA凝胶化油脂的1H-NMR图谱在δ0～5.5范围内出现9 个信号峰[31]，这些信号峰主要由油脂中甘油三酯的不同结构中H质子产生。图7B、C分别为12-HSA凝胶化油脂在热氧化过程中形成氢过氧化物及共轭烯等初级氧化产物（δ5.7～6.7）和形成醛类物质等次级氧化产物（δ9.5～9.8）的1H-NMR谱图[32-33]。数据显示，12-HSA凝胶化油脂在70 ℃下，随着时间延长，初级氧化产物和次级氧化产物的量均逐渐增加，其中峰4（与过氧化氢基团双键相关的质子）、峰5（顺,反-共轭二烯）、峰6（反,反-共轭二烯）和峰9（n-烷醛）信号增强明显。

图7 2% 12-HSA凝胶化油脂氧化的1H-NMR谱图Fig.7 1H-NMR spectra of oxidized 2% 12-HSA-containing oleogels

Rao为脂肪族质子（δ0.6～2.5）与烯质子（δ5.1～5.4）的峰面积积分的比值，Rad为脂肪族质子（δ0.6～2.5）与二烯丙基亚甲基质子（δ2.6～2.9）的峰面积积分的比值[18]。随着12-HSA凝胶化油脂热氧化的加剧，Rao及Rad均有所增加。这是因为在12-HSA凝胶化油脂在氧化过程中，二烯丙基会被自由基攻击，且烯族类发生分子内重排，因此二烯丙基、烯族类（不饱和双键）的信号峰出现不同程度的降低，饱和脂肪族上质子信号峰则相应增加，这些底物信号峰的变化随着油脂氧化程度的增加而加剧。如图8所示，Rao、Rad与TOTOX相关性较高，其中图8A的斜率大于图8B的斜率，表明烯族（一个双键）质子到脂肪族质子的相对转化速率要慢于二烯丙基（两个双键）质子。高场NMR分析为凝胶化油脂提供了一种快速、无损氧化稳定性评估方法。

图8 添加量2%的12-HSA凝胶化油脂在70 ℃储藏过程中的TOTOX和Rao、Rad相关性分析Fig.8 Correlation analysis between total oxidation value of 2%12-HSA-containing oleogels stored at 70 ℃ and their Rao and Rad

3 结 论

本实验研究了12-HSA凝胶剂对凝胶化大豆油氧化的影响。结果表明，在传统氧化指标测定中，12-HSA凝胶剂能与酸价测定中的KOH滴定液反应，油脂中游离脂肪酸的真实酸价应为含有12-HSA油脂的实测酸价减去因12-HSA消耗KOH所产生的酸价；12-HSA的促氧化能力低于硬脂醇及硬脂酸；添加量2% 12-HSA凝胶化油脂的稳定凝胶结构能减缓氧化反应；当凝胶结构在高温下被破坏时，体系向促氧化方向进行并在温度高于120 ℃时促氧化作用明显加速；1H-NMR图谱显示，12-HSA凝胶化油脂的初级氧化产物和次级氧化产物分别集中在化学位移δ5.7～6.7及δ9.5～9.8处，信号峰强度均随贮藏时间延长而不断增强，并且1H-NMR的Rao和Rad与TOTOX相关性较好。