叶酸和辛烯基琥珀酸酐双修饰菊粉胶束对姜黄素的荷载特性

李若华，杨 华，雷 琳,2，叶发银,2，赵国华,2,

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715）

姜黄素是从姜黄（Curcuma longaL.）中提取出来的一种黄色多酚类化合物（图1），具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤的效果[1]。但姜黄素不溶于水，对光、热敏感，在碱性条件下极不稳定，因此姜黄素生物利用度不高，其在食品和药品领域的应用也受到了限制。具备壳-核结构的两亲性多糖自聚集胶束常被用作食品功能成分的输送体系来提高脂溶性活性物质的生物利用度及稳定性[2]。两亲性多糖是指通过特定化学反应，将疏水性基团导入天然水溶性多糖而获得的两亲性产物，具有良好的生物降解性，且安全无毒。近年来透明质酸、菊粉和壳聚糖等多糖及其衍生物经疏水化改性后常用于制备安全稳定的胶束给药体系[3-5]。目前，多种材料已应用到姜黄素聚合物胶束的制备当中。Stanciu等[6]以右旋糖酐和脱氧胆酸为原料制备的两亲性嵌段共聚物在水介质中形成粒径50～600 nm的球状胶束聚集体，使荷载姜黄素的溶解度提高了68 181 倍，药物释放缓慢。Sajomsang等[7]发现，经N-苄基化和N-O-琥珀酰化形成的两亲性壳聚糖，自组装胶束粒径小（100 nm），在4 ℃和25 ℃环境中具有良好的贮藏稳定性，是一种有效的口服姜黄素给药载体。此外，具有pH[8]和温度[9]敏感性的荷载姜黄素聚合胶束应运而生，它们能在特定的作用部位快速释放姜黄素达到有效浓度，起到靶向治疗作用。

图1 姜黄素化学结构式Fig.1 Chemical structure of curcumin

对自组装胶束外壳进行化学修饰可实现主动靶向功能，提高胶束对靶细胞的主动识别和靶向能力。叶酸受体是一种分布在细胞表面的膜蛋白，在大部分上皮肿瘤细胞呈高水平表达，如子宫癌、卵巢癌、结肠癌、乳腺等细胞[10]。作为水溶性B族维生素的成员之一，叶酸分子质量小、易于修饰和穿透肿瘤细胞、免疫原性低，其修饰的载药胶束能被高效导入肿瘤细胞[11]。研究表明，通过对胶束进行叶酸修饰能更有效地靶向肿瘤细胞，提高制剂对肿瘤细胞的杀伤作用[12]。对于叶酸受体表达过量的人宫颈癌HeLa细胞和口腔鳞癌KB细胞，叶酸修饰载药胶束的细胞摄取及细胞毒性均明显强于普通载药胶束。动物实验进一步表明，叶酸修饰载药胶束的平均抑瘤率比普通载药胶束高16%[13]。

鉴于叶酸修饰载药胶束的特点，如能构建叶酸主动靶向运输体系，高效稳定地向结肠输送姜黄素，将有益于人体肠道健康。因此本研究以辛烯基琥珀酸酐（octenyl succinic anhydride，OSA）为疏水改性剂，菊粉为天然水溶性多糖，制备叶酸和OSA双修饰菊粉（folic acid octenylsuccinate inulin，FA-OS-菊粉）胶束，对荷载姜黄素的稳定性和释放特性进行评价，以期为叶酸修饰荷载姜黄素胶束在食品工业中应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菊粉（果聚糖质量分数≥90%，重均摩尔质量2751 g/mol） 白银希瑞生物工程有限公司；OSA、P7000胃蛋白酶、P7545胰酶 美国Sigma-Aldrich公司；叶酸（纯度＞97%），姜黄素（纯度＞98%），N,N'-羰基二咪唑（N,N'-carbonyldiimidazole，CDI）上海Adamas试剂公司；K2HPO4、KH2PO4、NaCl、羧甲基纤维素钠 成都市科龙化工试剂厂；透析袋（截留分子质量1 000 kDa） 美国Union Carbide公司。

1.2 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司；Zetasizer Nano ZS90动态散射光粒度分析仪 英国马尔文仪器有限公司；F2 500荧光分光光度计 日本日立仪器有限公司；HWS-26恒温水浴锅 上海齐欣科学仪器有限公司；T 25 ULTRA-TURRAX高速分散仪 德国IKA公司；HJ-4A磁力搅拌器 金坛市科析仪器有限公司；TGL-16G台式离心机 上海安亭科学仪器厂；LGJ-10真空冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司；QL-866漩涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Spectrum 100红外光谱仪 美国Perkin-Elmer公司；AV 600核磁共振仪 瑞士Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 不同菊粉基样品的制备

参照文献[14]制备OSA修饰菊粉（octenylsuccinate inulin，OS-菊粉）：准确称取5 g菊粉于90 mL纯水并匀速搅拌（300 r/min），逐滴加入1.4 mL质量浓度1 g/mL OSA溶液并用质量分数3%的NaOH溶液维持体系pH值为8～10，45 ℃搅拌5 h后，用质量分数3% HCl溶液将pH值调至6.5，随后分别用自来水、50%乙醇溶液和纯水各透析12 h。透析后的溶液经冷冻干燥后，得到OS-菊粉储存在－80 ℃备用。按照Dan Qiu等[15]的方法，检测样品的OSA取代度（octenylsuccinate substitution degree，DSO）。

参照文献[16]制备FA-OS-菊粉：将近似等物质的量的叶酸（0.001 1 mol）和稍过量的催化剂CDI（0.001 2 mol）溶解于盛有15 mL无水二甲基亚砜的具塞锥形瓶中，25 ℃、250 r/min下振荡14 h，得到叶酸活性酯。将上述OS-菊粉和10.83 mL叶酸活性酯混匀，25 ℃、250 r/min下振荡5.45 h后，加入4 倍体积丙酮搅拌均匀后室温避光静置12 h。混合液离心（4 000 r/min、20 min）后所得沉淀溶解于20 mL 1 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，分别用磷酸缓冲盐溶液、自来水和纯水各透析24 h（每6 h更换一次溶液）。透析后的溶液经冷冻干燥后得到FA-OS-菊粉，储存于－80 ℃备用。检测样品DSO后，按照Dubé等[17]的方法检测样品叶酸取代度（folic acid substitution degree，DSF）。

制备叶酸-菊粉（folic acid-inulin，FA-菊粉）：将26.06 mL叶酸活性酯和5 g菊粉混匀，25 ℃、250 r/min下振荡6.19 h，加入4 倍体积丙酮搅拌均匀后室温避光静置12 h。参照FA-OS-菊粉制备中离心、溶解、透析、冷冻干燥的方法，得到FA-菊粉并储存在－80 ℃备用。检测样品DSF。

1.3.2 FA-OS-菊粉的结构分析

傅里叶变换红外光谱分析：取3 mg样品加入150 mg烘干的溴化钾粉末研细、混匀、压模制片，置于红外光谱仪中进行扫描，波数范围为500～4 000 cm－1，分辨率为4 cm－1，以实时空气为空白[18]。

核磁共振氢（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）谱图分析：参考Muley等[19]的方法，将10 mg样品溶于1 mL二甲基亚砜-d6，置于核磁共振仪中，在50 ℃，400 MHz条件下进行分析。

1.3.3 临界胶束浓度的测定

参考Muley等[19]的方法，准确称取20 mg样品配制成质量浓度为1.0 mg/mL的自聚集溶液，稀释成不同质量浓度的溶液，以芘为荧光探针，用荧光分光光度计测定菊粉、OS-菊粉、FA-菊粉和FA-OS-菊粉溶液在300～360 nm波长范围的激发光谱。发射和激发狭缝分别为10、5 nm，以芘在338 nm和333 nm的荧光强度比（I338/I333）与质量浓度的对数做图，图中曲线突变点对应的质量浓度即为临界胶束浓度（critical micelle concentration，CMC）。

1.3.4 荷载姜黄素菊粉基胶束溶液的制备

将40 mg菊粉、OS-菊粉、FA-菊粉和FA-OS菊粉分别溶于20 mL的水中，各加入10 mg姜黄素，依次在均质仪中处理2 min（15 000 r/min、1 min；12 000 r/min、1 min），所得分散液在30 ℃下搅拌24 h后离心（8 900 r/min、10 min），收集上清液，即得荷载姜黄素菊粉基胶束溶液。采用高效液相色谱法测定上清液姜黄素质量浓度[20]，按公式（1）计算菊粉基胶束对姜黄素的荷载力。

式中：ρ1表示姜黄素在菊粉基胶束溶液中的质量浓度/（μg/mL）；ρ2表示菊粉基胶束溶液中菊粉基胶束的质量浓度/（mg/mL）。

1.3.5 粒径和多分散性指数的测定

采用动态光散射法测定粒径和多分散性指数（polydispersity index，PDI）。分别将2 mL荷载姜黄素菊粉基胶束溶液放入动态散射光粒度分析仪样品池进行测定。测定条件：氩离子激光器，波长633 nm、温度（25±0.1）℃、散射角90°[20]。

1.3.6 荷载姜黄素FA-OS-菊粉胶束稳定性研究

1.3.6 .1 热稳定性研究

分别配制不同荷载姜黄素菊粉基胶束溶液于5 mL玻璃具塞试管中，各在50、70、90 ℃下恒温水浴加热，分别在10、20、30 min时取出试管，测定样品粒径、PDI、姜黄素质量浓度，并按照公式（2）计算姜黄素保留率。

式中：ρt表示一定时间间隔后胶束溶液中姜黄素质量浓度/（μg/mL）；ρ0表示胶束溶液中初始姜黄素质量浓度/（μg/mL）。

1.3.6 .2 冻融稳定性研究

分别配制不同荷载姜黄素菊粉基胶束溶液于玻璃具塞试管中（5 mL），－18 ℃下冷冻22 h后，25 ℃下解冻2 h，以此为一次冻融循环，重复处理5 次。每冻融循环1 次后，测定样品粒径、PDI和姜黄素保留率。

1.3.6 .3 贮藏稳定性研究

分别配制不同荷载姜黄素菊粉基胶束溶液于玻璃具塞试管中（5 mL），分别在25、4 ℃下避光贮藏，分别在6、12、18、24、30 d时取出试管，测定样品粒径、PDI和姜黄素保留率。

1.3.7 荷载姜黄素FA-OS-菊粉胶束的体外模拟胃肠液消化稳定性及释放特性

1.3.7 .1 模拟胃肠液消化稳定性研究

按照Wu Zhen等[21]的方法制备模拟胃液（pH 1.2，含3.2 mg/mL胃蛋白酶、2.0 mg/mL NaCl）和模拟肠液（pH 7.0，含10.0 mg/mL胰酶、6.8 mg/mL KH2PO4）。取荷载姜黄素胶束溶液按1∶3（V/V）分别与模拟胃肠液混合（共16 mL）于具塞试管中并充分混匀；恒温振荡器处理（150 r/min、37 ℃）。研究模拟胃液消化稳定性时，分别在10、20、30、60、90 min时取出3 mL模拟胃消化液；研究模拟肠液消化稳定性时，分别在30、60、120、240、360 min时取出3 mL模拟肠液。测定样品粒径、PDI和姜黄素保留率。

1.3.7 .2 模拟胃肠液释放特性研究

取2 mL荷载姜黄素菊粉基胶束溶液于试管中，并按照模拟胃肠液盐离子比例添加相应量的NaCl和KH2PO4，混合均匀后，转移至透析袋中。将透析袋移至含有体积分数10%吐温-80溶液的50 mL模拟胃肠液中，恒温振荡器处理（150 r/min，37 ℃）。研究模拟胃液释放特性时，分别在10、20、30、60、90 min时取出1 mL透析袋外液待测，再补充加入1 mL模拟胃液；研究模拟肠液释放特性时，分别在30、60、120、240、360 min取出1 mL透析袋外液待测，再补充加入1 mL模拟肠液。采用高效液相色谱法测定模拟肠液中姜黄素质量浓度[20]，按照公式（3）计算姜黄释放率。

式中：ρt表示一定时间间隔后透析袋外液中姜黄素质量浓度/（μg/mL）；ρ0表示透析袋内液中初始姜黄素质量浓度/（μg/mL）；50和2分别为透析袋外液和内液的体积/mL。

1.4 数据处理与分析

每个样品重复测定3 次，采用SPSS 19.0软件进行数据分析，结果均以平均值±标准差表示。采用单因素方差中的Tukey多重比较分析样品间的显著性差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 FA-OS-菊粉的结构表征结果

2.1.1 傅里叶变换红外光谱分析

OS-菊粉DSO为0.041；FA-菊粉DSF为0.150；FA-OS-菊粉DSO为0.039，DSF为0.149。3 400、2 931、1 030 cm－1处的吸收峰分别为菊粉中羟基（－OH）、亚甲基（－CH2）的伸缩振动吸收和糖环上醚键（C－O－C）的弯曲振动[14]。由图2可知，与菊粉红外光谱图相比，OS-菊粉和FA-OS-菊粉在1 729和1 562 cm－1处出现新吸收峰，其分别归属于OSA和菊粉羟基脱水形成的酯羰基（－CO－）振动吸收和羧酸盐（ROO－）的不对称拉伸[18,22]。FA-菊粉和FA-OS-菊粉在842.5 cm－1处为叶酸芳香环上＝C－H的特征吸收峰，1 604、1 515 cm－1处新出现的吸收峰归属于酯化反应引入的叶酸苯环上的C＝C吸收振动峰[23]。这些吸收峰证实了叶酸和OSA通过酯键连接到菊粉分子上。

图2 菊粉及菊粉酯傅里叶变换红外扫描图谱Fig.2 Fourier transform infrared spectra of inulin and its folic acid conjugates

2.1.21H NMR谱图分析

FA-OS-菊粉的1H NMR谱图分析如图3所示，对照为未添加催化剂CDI的FA-菊粉。δ3.14～δ5.16附近的特征峰归属于菊粉[14]。δ0.84和δ1.25处的特征峰分别为OS末尾碳原子上氢原子的化学位移和与之相邻的四个亚甲基的质子位移形成的，δ1.94 处的特征峰属于OSA中靠近辛烯基双键的碳原子上的质子位移[17]。与OS-菊粉氢谱相比，FA-OS-菊粉的图谱出现了属于叶酸的新质子峰：δ6.65和δ7.63分别为叶酸苯环上的两个邻位氢，δ8.64处为叶酸蝶啶环的质子峰[24]。结果表明，叶酸已成功修饰FA-OS-菊粉。

图3 菊粉及菊粉酯1H NMRFig.3 1H Nuclear magnetic resonance spectra of inulin and its folic acid conjugates

2.2 荷载姜黄素胶束的荷载特性

菊粉作为大分子多糖在水和盐溶液中均具有自聚集性，由表1可知，与菊粉胶束相比，OS-菊粉胶束、FA-菊粉胶束和FA-OS-菊粉胶束的CMC显著降低，说明改性后胶束的稳定性显著提升。这可能是因为添加OSA使菊粉的疏水基团增加，导致疏水链间的作用增强，促进分子间和分子内疏水区的形成[25]；叶酸分子的羧基被接枝到菊粉分子上，叶酸分子剩余部分的疏水性逐渐增强，在自聚集溶液自组装形成胶束时，被接枝的叶酸受到的水分子排斥力增强，导致叶酸修饰菊粉疏水性增加，更易于自组装形成胶束，从而提高了胶束的稳定性[24]。与菊粉胶束相比，OS-菊粉胶束、FA-菊粉胶束和FA-OS-菊粉胶束粒径和PDI均减小，说明添加OS、叶酸使得胶束粒径和分散程度更均匀。

表1 菊粉及菊粉酯DSO、DSF和菊粉基胶束姜黄素荷载力及荷载前后胶束粒径、PDI的变化Table 1 Octenylsuccinate substitution degree and folic acid substitution degree of inulin and modified inulin, and the loading capacity, changes in particle size and PDI of inulin-based micelles before and after curcumin loading

菊粉胶束对姜黄素的增溶作用主要依赖于多糖的亲水主链，其形成的卷曲、螺旋等结构的非共价结合作用可对姜黄素进行吸附和封装。荷载姜黄素后，FA-菊粉胶束和FA-OS-菊粉胶束粒径显著增加，PDI显著下降。与菊粉胶束相比，OS-菊粉胶束、FA-菊粉胶束和FA-OS-菊粉胶束的姜黄素荷载力分别提高了9.5、15.4、12.8 倍。OS-菊粉胶束的姜黄素荷载力（3.079 μg/mg）小于OS-燕麦胶束的姜黄素荷载力（4.210 μg/mg）[20]，这可能是因为两亲性多糖结构特性（如取代度和疏水基团长度）不同所致。而叶酸修饰则显著提高菊粉的姜黄素荷载力（FA-菊粉，4.775 μg/mg；FA-OS-菊粉，4.041 μg/mg）。这可能是因为：1）叶酸接枝降低了胶束CMC，提高了胶束的稳定性；2）叶酸与姜黄素之间的π-π疏水作用和静电作用更有利于荷载姜黄素。菊粉经叶酸、OSA双修饰后，取代度之和较大，所形成的胶束使烷基链增长，对姜黄素的包埋产生空间位阻效应[20]，因此FA-OS-菊粉对姜黄素的荷载力低于FA-菊粉。

2.3 荷载姜黄素胶束的稳定性

2.3.1 热稳定性

由表2可知，与0 min相比，热处理能改变荷载姜黄素菊粉基胶束的粒径和PDI，破坏胶束结构的完整性。然而，与菊粉胶束相比（90 ℃处理30 min，姜黄素保留率5.40%），OS-菊粉胶束内核的疏水性能保护姜黄素，抑制姜黄素的热降解（90 ℃处理30 min OS-菊粉，姜黄素保留率29.07%）。叶酸与姜黄素的π-π疏水作用和静电作用能有效抑制胶束表面姜黄素的迁移[26]，因而叶酸修饰荷载姜黄素胶束能更有效地保留胶束内核姜黄素（90 ℃处理30 min，FA-菊粉姜黄素保留率37.20%，FA-OS-菊粉姜黄素保留率46.60%）。

表2 不同加热处理下荷载姜黄素菊粉基胶束的粒径、PDI以及姜黄素保留率变化Table 2 Changes in particle size, PDI and retention of curcumin of inulin-based micelles loaded with curcumin under different heat treatments

2.3.2 冻融稳定性

如图4所示，随着冻融次数的增加，荷载姜黄素菊粉胶束的粒径和PDI不断增加，而OSA、叶酸修饰能抑制冻融对胶束粒径和PDI改变。5 次冻融循环后，与菊粉胶束相比（姜黄素保留率14.2%），OSA、叶酸修饰使胶束中的姜黄素的保留率提高到44.2%～66.4%，可有效阻止姜黄素溶出。此外，与OS-菊粉胶束和FA-菊粉胶束相比，FA-OS-菊粉胶束姜黄素保留率较低，这可能是因为冻融处理能促进FA-OS-菊粉胶束内核中姜黄素的溶出。

图4 冻融循环次数对荷载姜黄素菊粉基胶束粒径（A）、PDI（B）以及姜黄素保留率（C）的影响Fig.4 Effects of freeze-thaw cycles on the particle size (A), PDI (B), and retention of curcumin (C) of inulin-based micelles loaded with curcumin

2.3.3 贮藏稳定性

由表3可知，随着贮藏温度的升高和时间的延长，荷载姜黄素菊粉胶束及其叶酸修饰物胶束的粒径和PDI均发生改变。PDI在静置状态下增加表明胶束在贮藏期间发生了聚集[27]，其分子的动态运动破坏胶束完整性，造成姜黄素泄露氧化。菊粉胶束于4 ℃和25 ℃贮藏30 d后，其姜黄素保留率分别显著下降至17.27%和12.30%（P＜0.05）；而叶酸修饰能显著提高胶束内核姜黄素的贮藏稳定性，FA-OS-菊粉胶束于4 ℃和25 ℃贮藏30 d后，其姜黄素保留率分别为65.37%和45.30%。

表3 不同贮藏条件下荷载姜黄素菊粉基胶束的粒径、PDI和姜黄素保留率的变化Table 3 Changes in particle size, PDI and retention of curcumin of inulin-based micelles loaded with curcumin under different storage conditions

2.4 体外模拟胃肠液对荷载姜黄素胶束的影响

将姜黄素输送到结肠的主要挑战之一是其在生理环境中的不稳定性。由图5、6可知，OSA、叶酸修饰菊粉胶束粒径在模拟胃液中没有明显变化，在模拟肠液中随时间的延长而增大；PDI在模拟胃肠液中均随时间的延长而增加。这可能是肠液具有更高的Na+浓度，盐离子掩蔽或中和胶束表面的电荷，削弱静电斥力，促进了胶束的靠近、结合，导致胶束粒径增大，胶束粒径分布不均匀使得PDI增大[28]。消化结束时，各组姜黄素在模拟胃液中的保留率均在90%以上；在模拟肠液中，除菊粉胶束的姜黄素保留率降低至42.2%，其余胶束的保留率均高于60%。其中，FA-OS-菊粉胶束有明显的姜黄素保护作用（姜黄素保留率：胃93.1%、肠66.2%）。这可能是叶酸基团的修饰作用屏蔽了一部分Na+，使胶束处于较好的稳定状态，提高姜黄素的保留率。模拟胃肠液的消化稳定性不同可能与姜黄素的pH敏感性有关[29]。姜黄素的羟基在碱性条件下容易发生脱质子，其降解速率随pH值增大而增大[30]。因此，胶束内核荷载的姜黄素在肠液中发生严重的脱质子现象，导致姜黄素发生自氧化。

由图5、6可知，与菊粉胶束相比（消化结束时姜黄素释放率：胃4.4%、肠22.6%），OSA、叶酸修饰菊粉基胶束均能有效抑制姜黄素在模拟胃肠液中的释放（消化结束时姜黄素释放率：胃1.5%～2.5%、肠7.8%～18.6%），且释放率顺序为：OS-菊粉＞FA-菊粉＞FA-OS-菊粉。研究表明，载药两亲性胶束由于疏水内核与药物分子之间的疏水相互作用可呈现药物的持续释放，这种释放是从亲水外壳开始逐步向疏水内核进行的，介质进入内核溶解药物，继而腐蚀和降解胶束载体材料[8,31]。当胶束外壳表面被叶酸基团覆盖时，介质较难靠近胶束内部，所以叶酸修饰明显降低了姜黄素在胃肠液中的释放率，这与Lü Yin等[25]的报道相似。表明FA-OS-菊粉胶束具有潜在的结肠靶向作用。

图5 模拟胃液对荷载姜黄素菊粉基胶束粒径（A）、PDI（B）和姜黄素保留率（C）、释放率（D）的影响Fig.5 Effects of simulated gastric fluid on the particle size (A), PDI (B),curcumin retention (C), and curcumin release (D) of inulin-based micelles loaded with curcumin

图6 模拟肠液对荷载姜黄素菊粉基胶束粒径（A）、PDI（B）和姜黄素保留率（C）、释放率（D）的影响Fig.6 Effects of simulated intestinal fluid on the particle size (A), PDI (B),curcumin retention (C) and curcumin release (D) of inulin-based micelles loaded with curcumin

3 结 论

本研究利用OSA和叶酸对菊粉进行修饰，研究发现，FA-OS-菊粉自聚集形成粒径均匀的胶束，能显著增强姜黄素荷载能力、热稳定性和贮藏稳定性，FAOS-菊粉胶束在模拟胃肠液中荷载姜黄素的释放较缓慢。因此，本研究表明，FA-OS-菊粉胶束能有效抑制姜黄素在模拟胃、肠液中的提前释放，具有潜在的结肠靶向效果。FA-OS-菊粉胶束在模拟结肠液中的释放特性，有待进一步深入研究。