利用纳米载体口服递送生物活性肽的研究进展

郝晓丽，吉日木图,2，何 静,

（1.内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古骆驼研究院，内蒙古 巴丹吉林 737300）

生物活性肽的一系列生物活性和功能特性（抗高血压、抗菌、抗氧化剂和免疫活性等）使其适合作为治疗剂或辅助治疗剂[1]。考虑到实际情况和消费者购买意愿，通过口服途径给药通常是最有利的。然而，生物活性肽在口服时需要克服一些阻碍，其中人类胃肠道内存在的严酷化学环境（如人体胃内的强酸性和酶活性胃液）是生物活性肽高效利用的最大障碍[2]。因此，生物活性肽需要使用递送系统来给药，以保护其在贮存和通过胃肠道期间不会降解，并在人体内特定的作用部位释放出来[3]。

1 生物活性肽口服给药递送的条件

目前，生物活性肽因其具有多种功能，对人体有极大的益处，而广泛应用于食品、药品等领域，但由于生物活性肽自身稳定性较低，所以在多种给药途径中口服是最直接有效的，然而由于肠胃环境酸度偏高，生物活性肽进入后能发挥的作用已经非常小，这大大降低了生物活性肽的活性，因此经载体包埋后递送生物活性肽的研究尤为重要。此外，递送系统的选择对生物活性肽的包埋、保护和输送极为重要。给药途径对不同生物活性肽发挥作用效果的影响均极为显著，因此给药方式格外重要。为了克服生物活性肽口服给药的不利环境，提高治疗生物活性肽的口服生物利用度，保证生物活性肽功能的有效性，越来越的多功能给药系统被设计和研究[4]。

1.1 递送的兼容性

生物活性肽可以封装在不同的功能性食品、补充剂、药用食品或药物制剂中。例如输送载体可以是液体、凝胶、粉末、胶囊或片剂。此外，这些产品在其保质期内会受到温度、光照、氧气、湿度等的影响。因此，输送载体必须经过精心设计，以确保生物活性肽被有效封装，而不会对产品所需的质量属性（外观、质地和口感）产生负面影响，并在生产、运输、贮存和使用过程中保持稳定[5]。

1.2 对胃肠道的稳定性

生物活性肽被摄取后，其三维结构和功能可能会随着其在人体胃肠道中的移动而改变。当其暴露在胃肠道内的流体中时，可能会发生水解、结构重排或聚集[5]。胃肠液的pH值差别很大，即从胃的高度酸性到十二指肠的中性或微碱性，各种消化酶（蛋白酶）也可以水解生物活性肽并改变其功能。此外，胃肠液含有生物表面活性剂（胆盐和磷脂），它们可能与生物活性肽结合并改变其生物活性。可通过将生物活性肽搭载在载体中来提高生物活性肽对胃肠道的稳定性，这些载体在到达目标区域（如口腔、胃、小肠或结肠等）之前不会分解，且对胃肠道液体中的应激物（如胆盐或消化酶）具有不渗透性或低渗透性，否则会降解包裹的生物活性肽。

1.3 胃肠道吸收方式与途径

生物活性肽因不能有效地被人体吸收而使其生物活性受到限制[5]。生物活性肽需要从其被包埋的基质中释放出来，然后在被上皮细胞吸收之前穿过胃肠液和黏液层（图1）。其传输速率和停留时间将取决于周围胃肠道液体的黏度，这可以通过添加增稠剂等成分来调节[6]。生物活性肽或包裹它们的载体物质尺寸必须足够小，才能穿透黏液层，一些递送系统中的颗粒尺寸相对较大（＞500 nm），因而无法完全穿透黏液层。然而，载体物质可能会在胃肠道内降解，从而释放出生物活性肽，并扩散到黏液层。一旦其到达上皮细胞表面，生物活性肽可能通过多种机制被吸收，如主动或被动的跨细胞途径、细胞旁路（紧密连接）途径或内吞作用[4]。此外，生物活性肽可被不同种类的上皮细胞（如肠上皮细胞或M细胞）吸收，这取决于其尺寸和表面化学性质，而M细胞在吸收载体颗粒（＜500 nm）方面通常比肠细胞更有效[3]。

图1 生物活性肽及其载体的吸收途径Fig.1 Absorption pathways of bioactive peptide and its carriers

由于许多生物活性肽的吸收率较低，因此必须开发特殊材质的载体来提高其吸收率[7]。一些渗透剂可将生物活性肽递送至其能有效发挥作用的部位，某些递送系统天然含有可以增加细胞膜通透性的成分（如表面活性剂或中链脂肪酸），这也可能有助于生物活性肽的吸收[8]。

2 生物活性肽的特性

2.1 分子尺寸

生物活性肽的尺寸和结构会影响其在递送系统中的滞留和释放。生物活性肽的分子质量一般在10 kDa以下，但不同种类小分子肽的三维结构各有差异，其形状大小、结构也不相同。经不同程度的纯化处理后得到的肽段纯度各有差异，有单组分的小分子肽，也有多组分的多肽，甚至有纯度较低且含有部分无其他特定功能物质的粗肽，这取决于其生物学功能、提取以及操作处理方法，因此，生物活性肽的分子尺寸分布范围可能从几纳米到几百纳米甚至更多[9-10]。在递送系统相分离时，如油包水微乳液、纳米乳液或乳液，生物活性肽如被成功包埋，其分子尺寸应该小于其包埋物的尺寸；此外，在生物聚合物微凝胶包埋的情况下，生物活性肽的分子尺寸应该大于组成这种胶体颗粒内部的生物聚合物网络的孔隙尺寸，以便其通过扩散来实现物理包埋和限制释放。

2.2 静电效应

生物活性肽的静电属性也会影响其在递送系统中的功能特性，因为生物活性肽的保留和释放取决于多肽和载体物质之间的静电相互作用[11]。由于大多数生物活性肽既有阴离子基团，又有阳离子基团，当pH值从高于等电点降至低于等电点时，其净电荷会从负电荷变为正电荷，因此，了解有关生物活性肽的电化学信息对于设计有效的递送系统通常是必不可少的。例如生物活性肽在生物聚合物微凝胶中的保留/释放会受到分子与微凝胶内生物聚合物网络之间静电相互作用的影响。当pH值低于生物活性肽的等电点时，其会被海藻酸盐、卡拉胶或果胶等阴离子生物聚合物通过静电吸引；但当pH值高于其等电点时，则被静电排斥[12]。因此，由于静电相互作用的改变，生物活性肽在阴离子生物聚合物中可能在低pH值时被保留，在高pH值时被释放。但是相反的现象会发生在阳离子生物聚合物上，如壳聚糖或聚赖氨酸。因此，若要开发出适合的递送系统，必须考虑所负载物质的电化学信息。除了考虑净电荷之外，生物活性肽复杂的化学和物理性质，在决定其与递送系统的相互作用方面也极为重要[13-14]。

2.3 极性、溶解性和表面活性

生物活性肽的极性是影响其包埋能力的另一个关键因素，其极性会影响生物活性肽的三维结构、溶解性、表面活性和分子相互作用。生物活性肽的极性、非极性或两亲性取决于多肽链中亲水和疏水氨基酸的数量和分布，而多肽链中亲水和疏水氨基酸的数量和分布又会影响生物活性肽在水溶液中的结构排列。极性基团能够与水分子形成偶极-偶极相互作用，而非极性基团则不能。分子折叠的一个主要驱动力是：暴露在水中的疏水非极性基团数量具有减少的趋势。因此，生物活性肽在水溶液中的溶解性取决于其表面极性。生物活性肽的表面活性取决于其表面极性基团和非极性基团的分布，许多多肽是两亲性分子，能够吸附到空气-水、油-水或固体-水界面，这使得其可以作为功能成分来稳定泡沫、乳液或悬浮液[15]。

2.4 物理和化学稳定性

生物活性肽的物理和化学稳定性会影响其功能性[16]。生物活性肽的三维结构和功能可能会被环境因素不可逆转地改变，如pH值、离子组成、温度、压力、溶剂种类或表面吸附能力。因此，确定并指定影响包埋生物活性肽性能的主要因素尤为重要，例如导致它们变性的温度或pH值。通常情况下，递送系统是专门设计的，通过将生物活性肽包埋在可以抵抗上述影响因素的物质中以增强其稳定性。

3 生物活性肽的给药递送系统

目前，建立生物活性肽的给药递送系统已成趋势，载体的选择范围较广，其中聚合物和纳米颗粒因可控制所携带的生物活性肽释放速率，或使其功能化以靶向特定的器官而最为常用[17]。纳米颗粒的靶向性可以通过表面功能化来获得，可以使用在生理体温（37 ℃）下融化的生物相容性脂质制备，生物活性肽包埋物在体温下不会融化，但会被肠液消化[18]。同时还可以保护不稳定和敏感的生物活性肽免受热、化学、光化学或氧化降解[19]。因此，纳米颗粒被认为是一种可用于不同给药途径的胶体药物载体递送系统。本文对近年来发表的以脂质颗粒、多糖颗粒、无机颗粒和合成功能颗粒为代表的治疗性多肽口服给药系统（图2）进行了系统的描述。

图2 生物活性肽载体的典型结构Fig.2 Typical structures of bioactive peptide carriers

3.1 脂质颗粒载体

脂质载体因其良好的生物相容性而备受关注，可跨越肠道屏障[20]，使生物活性肽在其特定发挥作用的场所释放，以保证其有效性。目前常用作载体的有脂质体、固体脂质颗粒、纳米乳化给药系统和多重乳状液。

3.1.1 脂质体

具有微泡结构的脂质体由水核和两亲双层组成。传统的磷脂/胆固醇脂质体在胃肠道中会发生磷脂水解或氧化，且磷脂易发生聚集、沉降[21]。脂质纳米载体是一种高效、稳定的生物活性肽递送系统，因其独特的脂质性质（由固体脂质和液体脂质混合而成），具有很好的耐受性和低毒性。与其他递送系统相比，其具有易包埋性、可容纳包埋空间大、有机溶剂残留量少等优势，可弥补乳状包埋载体物质、脂质体、聚合物纳米粒和固体脂质纳米粒等胶体载体所存在的部分局限性[22-23]。Niu Mengmeng等[24]研究发现含有胆盐的脂质体显示出在人体内运输环境下更长的停留时间和更强的跨膜渗透能力。Cui Meng等[25]筛选的植物来源的麦角甾醇脂质体可显著提高胰岛素的口服生物利用度。为提高包封生物活性肽的口服生物利用度，脂质体应保持其泡状形态，并通过抵抗胆盐、胰酶和胃肠道中酸性条件对其的破坏来避免包埋物质的早期泄漏[26]。

3.1.2 固体脂质颗粒

固体脂质颗粒由天然、半合成或合成的脂质制成，其含有甘油三酯、脂肪酸、磷脂和类固醇，被广泛认为是安全、可生物降解的载体物质[27]。固体脂质颗粒具有较好的生物相容性，但却易被降解，因此利用效能较低，不能保证包埋物质能够到达有效的作用部位后再释放。Christophersen等[28]研究了含有不同类型脂质辅料的固体脂质颗粒在生物活性肽释放后的降解机制，结果表明，加入溶菌酶后其释放速率变快。然而，固体脂质颗粒的疏水性限制了其对亲水性多肽的包封性。

3.1.3 纳米乳化给药系统

纳米乳化给药系统是一种水包油型纳米乳液，由油、表面活性剂和助表面活性剂的各相同性混合物通过与水混合而自发形成[29]。Karamanidou等[30]开发了一种新的黏液渗透纳米乳化给药系统配方，发现加入胰岛素/二肉豆蔻基磷脂酰甘油的疏水离子后黏液的渗透性增强。据报道，较小的纳米乳化给药系统具有更高的黏液渗透能力，并且阴离子纳米乳化给药系统的渗透速率比阳离子纳米乳化给药系统更好[31]。尽管如此，由于纳米乳化给药系统的疏水性，用于输送包含生物活性肽亲水性药物的纳米乳化给药系统被认为是极具挑战性的。

3.1.4 多重乳状液

多重乳状液是简单乳化剂在外相中的液体或半固体分散体系，可以保护药物不受酶水解的影响，并作为药物载体通过肠道屏障以增加吸收[32]。Dogru等[33]设计了一种用于口服降钙素钠的水包油包水（W/O/W）的多重乳状液配方，与商业制剂相比，其对大鼠产生了类似的血清钙效应。虽然多重乳状液是一种常用的生物活性肽口服给药方法，但不稳定和粒径大的缺点限制了其应用。

3.2 多糖类载体

多糖被认为是安全性高、生物相容性好、可生物降解的高分子质量天然生物材料。大多数多糖都含有羟基、羧基和氨基等亲水性基团，这些基团可以与肠道黏液形成非共价键，并促进生物活性肽的吸收[34]。

壳聚糖及其衍生物由甲壳素碱性脱乙酰制得，是由N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖组成的阳离子共聚物，具有低毒的pH值响应性，通过与黏膜表面的阴离子唾液酸残基相互作用实现黏附性，并通过可逆地调节肠上皮细胞的紧密连接来促进生物活性肽的渗透作用。而壳聚糖基纳米颗粒因其口服递送生物活性肽的能力较强而受到越来越多的关注。Zhang Peiwen等[35]开发的胰岛素-十二胺接枝聚谷氨酸胶束证明纳米粒口服后具有良好的降血糖作用，相对生物利用度为7.05%，人体血糖水平的下降速率比未修饰纳米粒高1.2 倍。除此之外，还有很多其他以多糖为基础的载体体系，右旋糖酐是一种复杂的支化葡聚糖，由长度较长（3～2 000 kDa）的链段组成。Soury-Kochavi等[36]研究了一种纳米微囊载体给药系统，其内部是由牛血清白蛋白和与三偏磷酸钠交联的右旋糖酐纳米颗粒混合物组成，可显著将口服促胰岛素类似物相对生物利用度提高至77%。聚唾液酸是一种高亲水性多糖，主要由α-2,8-酮苷键连接的5-N-糖基神经氨酸组成，可作为聚乙二醇的合适替代内源物质。从褐藻中提取的褐藻酸盐是由α-L-古糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸组成的天然水溶性线性多糖，二者均为阴离子化合物，其特点是能够在二价阳离子（如钙离子）存在的情况下形成水凝胶，并因其pH值敏感性和低成本而在口服给药方面具有显著优势。

3.3 胶体颗粒载体

用于包埋生物活性肽的胶体颗粒特性取决于其自身以及用于给药的最终产品性质[37]。胶体颗粒包埋、保护和输送生物活性肽能力是选择载体的重要考虑因素。用于包埋生物活性肽的胶体颗粒可以使用一系列不同的可食用成分来生产，如蛋白质、多糖、脂类、磷脂和表面活性剂[38]。而这些成分会影响胶体颗粒的功能属性（例如包埋、保护、保留和释放生物活性肽的能力）。因此，选择最合适的成分来制作载体是至关重要的。同时，胶体颗粒的形态和尺寸也必须加以控制。可以生产直径10 nm～1 mm的胶体颗粒，具体取决于用于组装生物活性肽的成分和制造工艺等。通常情况下，胶体颗粒是球形的，但也可以是其他形态，如椭圆形、立方体形、纤维状或不规则形。而载体的滞留/释放特性可以通过调整粒径来控制，较大粒径的载体具有较高的保留率和较慢的释放速率。酶可消化颗粒的降解率会随着颗粒尺寸的减小（比表面积增大）而增大。颗粒的粒径也会影响其穿透黏液层的速率和上皮细胞对其的吸收，较小的颗粒通常具有较高的透过性[39]。除此之外，胶体粒子的界面特性（如化学、极性、电荷、流变性和厚度）对其功能属性（如物理化学稳定性和与表面的相互作用）起重要的作用。这些特性可以通过组装不同成分的胶体颗粒来控制。表面电荷可以通过将带电乳化剂或生物聚合物吸附到其表面来控制。胶体颗粒可以作为均匀分布在整个系统中的单个个体存在，也可以作为大小和形状不同的簇状存在。胶体粒子的聚集状态往往会影响其功能性质。研究显示，团簇的形成可能会降低重力分离的稳定性，增加黏度，降低胶体颗粒的胃肠道消化率，或者降低其穿透黏液层的能力[40]。由于这些原因，控制胶体颗粒的聚集状态通常是至关重要的。胶体粒子的选择决定了其组成的递送系统对生物活性肽的包埋、保护和释放等功能特性[41]。研究表明，使用乳化-凝胶法制造的多糖微凝胶包埋胰岛素口服，当其暴露在模拟胃液中时，微凝胶抑制了胰岛素的分解，但当其暴露在模拟肠液中时，微凝胶能够释放胰岛素[42]。证明了胶体粒子载体可将生物活性肽递送至发挥作用的部位。

3.4 无机粒子载体

一些无机纳米管（金纳米颗粒、硒纳米颗粒、硅纳米颗粒、铝纳米颗粒（例如TiO2、磷酸锆）[43]）已经成功地应用于口服生物活性肽的包埋。与有机基质相比，这些材料在酸性和酶环境中具有更高的稳定性。Cho等[44]制备了粒径约120 nm的以硫酸软骨素为稳定剂包埋的金纳米颗粒/胰岛素，口服2 h后血浆中胰岛素的平均浓度是口服胰岛素溶液组的6.61 倍。研究表明，硒可以改善胰岛功能和葡萄糖利用，具有与胰岛素相似的降血糖作用[45]。大比表面积和高孔隙率的硅纳米粒子具有优异的生物相容性和生物降解性，是用于生物活性肽包埋载体的很有前途的候选材料。更重要的是，硅纳米颗粒的表面含有残留的硅醇基，可以被不同的有机基团官能化。硅可以通过形成稳定的网络和坚硬的保护屏障来防止乳滴的聚结，Mohanraj等[46]开发了一种使用脂质体作为模板来沉积硅的混合纳米胶囊，发现该缓释剂可使控释率提高。此外，其还通过无机材料包覆的杂化载体实现了控释。

3.5 合成高分子聚合物载体

近年来，一系列易于功能化的可生物降解的高分子纳米粒已被合成，并应用于生物活性肽的口服给药系统，以提高其稳定性，实现控释[47]。黏膜层起到保护屏障的作用，可以捕获异物颗粒并随后将其清除，从而降低纳米颗粒穿过肠道吸收膜的可能性。聚乙二醇由于其空间位阻效应，使纳米颗粒更亲水，通过使纳米颗粒形成黏液来防止其聚集。Inchaurraga等[48]通过体内实验评估了聚乙二醇包埋的聚酐纳米颗粒的黏液穿透能力，结果表明其黏液穿透能力受聚乙二醇分子质量和表面密度的影响较大。聚乙二醇2000或聚乙二醇6000包埋纳米颗粒的黏液穿透能力高于聚乙二醇10000包埋纳米颗粒，而过高密度的聚乙二醇包埋纳米颗粒的黏液穿透能力较低。然而，在较快的黏液渗透速率和上皮细胞内转移速率之间选择合适的材料是极其困难的。聚丙交酯-乙交酯是一种很有应用前途的药物载体，且已被美国食品药品监督管理局批准应用于生物医学领域。Li Xiuying等[49]发现包埋了亲水性聚合物的纳米颗粒与黏液层的黏附性较小，为了进一步提高纳米颗粒的黏液渗透性，其设计了以壳聚糖纳米颗粒为核心、以聚醚F127-脂泡为外壳、以聚氧化乙烯为冠层的核壳电量纳米脂质微球，发现与目前常用的生物活性肽包埋载体物质相比，其具有更高的黏膜穿透效率。黏液以动态凝胶的形式不断分泌、脱落和消化，在许多情况下，黏液在包埋物到达底层细胞并进入血液循环之前清除药物载体。通过木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶等裂解黏液上的黏糖蛋白亚基，是达到上皮细胞的一种很有应用前景的技术。虽然许多以合成聚合物为载体的口服生物活性肽递送系统已经建立，但这些聚合物在毒理学评价、生物相容性和生物降解性方面仍面临巨大的挑战。

4 纳米颗粒包埋技术的应用

纳米颗粒已被广泛应用于生物活性肽的包埋、保护和输送。脂质体纳米颗粒已经被应用于包埋胰岛素、抗癌肽和病毒抗原的临床中；此外，如消化酶和部分生物活性肽也已被人们广泛关注，但并不是所有应用都是口服的[50]。

4.1 消化酶

对于患有营养不良或胃肠道不适，无法在肠道（特别是小肠）自然产生足够消化酶的患者，有效改善给药方式将会对其有极大的帮助。例如乳糖不耐受患者可以口服乳糖酶，而胰腺炎患者可以口服胰腺脂肪酶[50]。消化酶的口服给药通常有一定的风险，因为当消化酶通过人体肠道时，会产生化学或物理上的改变，特别是当其到达人类富含酶和高度酸性的胃部环境时，可能会发生变性。这些问题可以通过将消化酶包埋在不同的递送系统中来克服，递送系统可以抑制消化酶在胃内的降解，但会使其在小肠内释放。已有部分研究证实了此现象，如研究表明，利用乳化技术将乳糖酶粉末包埋在可消化的小脂肪液滴中口服，发现包埋的乳糖酶在模拟胃肠道条件下仍可保持活性[51]。除此之外，乳糖酶还可被包埋在使用乳液蒸发方法而生产的疏水聚合物胶囊中，经模拟胃肠模型消化后，胶囊在胃部环境下还可保护乳糖酶不被降解，但会使其在小肠环境下释放[52]。乳糖酶被包埋在由海藻酸钙组装的生物聚合物微凝胶中时，微凝胶中含有一种不溶性抗酸剂，当其暴露在酸性条件下时，会慢慢溶解。因此，即使微凝胶浸泡在胃液中，其内部的pH值也保持相对恒定，还可用来包埋和保护胰腺脂肪酶，使其在胃环境下不被降解[53]。各种其他类型的递送系统（如生物聚合物微凝胶、脂微粒子和植物基微胶囊[54]）均可被用来包埋乳糖酶，并使其在胃肠道环境下不被降解。

4.2 血管紧张素转换酶抑制肽

一些生物活性肽由于其含有能够降低血压的血管紧张素转换酶抑制剂而被用于治疗高血压患者，但是口服这些生物活性肽并不是最佳的选择，因为其味道极苦，且可能在人体肠道内被水解，从而降低其生物活性[55]。因此，将通过研发新的递送系统，以达到掩盖其令人不快的味道，并抑制其在胃内的降解的目的，同时使其释放到小肠内后再被吸收；而另一种方法则是使用递送系统来控制人体肠道内蛋白质的水解，使血管紧张素转换酶抑制剂在胃肠道中的适当位置发挥作用。研究显示，血管紧张素转换酶抑制剂通过乳化法被加入由壳聚糖和海藻酸钠制成的生物聚合物微凝胶中，经模拟消化模型后微凝胶保护包埋的生物活性肽不被胃液降解，但随后会在小肠中得以释放[56]。

4.3 抗菌类生物活性肽

某些生物活性肽显示出较强的抗菌活性，因此可用于预防或控制微生物感染，包括溶菌酶、乳链菌肽和细胞穿透肽。而这些抗菌剂的有效性往往是有限的，因为其对化学降解很敏感，或更倾向于与环境中的其他物质相互作用。递送系统可以帮助保持或增强其抗菌效果[57]。研究表明，包埋在油包水微乳液中的抗菌生物活性肽比游离的抗菌生物活性肽具有更高的抗大肠杆菌活性[58]。将乳链菌肽和溶菌酶包埋在磷脂脂质体中可以提高其对单核细胞增生李斯特菌的抗菌活性。同样，将乳链菌肽包埋在生物聚合物纳米颗粒中，发现乳链菌肽对单核细胞增生李斯特菌的抗菌活性也得到了提高[59]。其他种类的递送系统也被证明能够提高特定抗菌蛋白的活性，例如脂质体中的乳链菌肽[60]、壳聚糖微胶囊[61]、果胶微粒[62]、海藻酸盐/果胶微粒以及玉米醇溶蛋白微粒和淀粉微凝胶中的溶菌酶[63]。

5 结 语

生物活性肽的口服生物利用度受到胃肠道环境的严重影响，为了克服这些影响，药物递送系统必须具备对生物活性肽的保护、改善其释放行为、增强其稳定性、提高机体的摄取等能力。尽管已有很多的给药递送系统显示出口服生物活性肽的应用潜力，但其在安全性和副作用、体外模型的典型性、制造技术的重复性、贮存条件的可行性和人体治疗效果的重复性等方面仍需进一步研究。综上所述，这些新的递送系统为口服生物活性肽开辟了一条新的道路，为之后的深入研究提供了一定的理论参考。