芯片式数字PCR（dPCR）检测晚期非小细胞肺癌（NSCLC）血液EGFR突变的应用价值

冷玉玲，吴奇琛，何章勇，徐进，章京红，吴东平，景奉香（通信作者）

（1.安徽中医药大学第二附属医院 肿瘤科，安徽 合肥 230001；2.海军安庆医院 胸外科，安徽 安庆 246003；3.上海奕检医疗科技有限公司，上海 200000；4.上海小海龟科技有限公司研发部，上海 200000）

0 引言

临床中80%的肺癌患者为非小细胞肺癌（NSCLC），大部分患者在首诊后就处于中晚期，传统治疗手段如放化疗等对于非小细胞肺癌的治疗并不理想[1]。靶向治疗是目前非小细胞肺癌治疗的重要手段之一，如EGFRTKI抑制剂，针对有靶基因敏感突变的患者，治疗的有效率会得到显著的提高[2]。病理组织样本是肺癌患者进行表皮生长因子受体（EGFR）基因检测的首选标本，但实际检测中组织样本的获取可能会受到多种临床因素的制约，甚至部分患者会出现无法获取组织样本的情况[2]。目前以EGFR基因为代表性靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI），是近年来NSCLC靶向治疗的重点，而EGFR基因突变是治疗的决定性条件，选择合适的检测方法（例液态活检），筛选合适患者进行靶向治疗是进行个体化精准治疗的目标[3]。在肿瘤组织标本无法获取情况下，国内大多检测方法选择扩增阻滞突变系统（ARMS）检验，而dPCR利用外周血循环肿瘤DNA（ctDNA）进行EGFR基因突变检测，这一新型检测方式已经获得了广泛认可[4]。本文将进一步分析与讨论芯片式数字PCR技术对于外周血循环肿瘤DNA的EGFR突变检测的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料。将2018年1月至2020年1月收治的40例NSCLC患者，含治疗后耐药患者18例。纳入标准：①均经过病理组织证实；②CT检测病灶长径≥10 mm；③心电图肝肾功能正常；④知情本文相关研究。排除标准：①造血功能出现障碍；②妊娠及哺乳期患者。所有患者男18例，女22例，年龄30～80岁，平均（61.54±4.07）岁，患者分布见表1。

表1 患者分布

1.2 方法

（1）所有患者均空腹抽取静脉血10 mL，耐药患者在治疗后抽取，2000×g离心5 min，取上清液，再次8000×g离心5 min，取上清，置于-20℃保存。

（2）血浆游离DNA提取：按照循环DNA核酸提取试剂盒（厦门艾德公司，批号02216060701X）进行操作，使用Qubit2.0荧光定量仪和Agilent 2100生物分析仪，分析DNA浓度与片段大小。以DNA浓度大于20 ng/μL，其中DNA片段为170 bp左右为合格。

（3）ARMS检测：使用ABI 7500荧光定量PCR仪及人类EGFR基因突变检测试剂盒（厦门艾德公司，批号01217081601X）检测EGFR基因突变，检测按照试剂盒说明书进行操作，并判读结果。

（4）dPCR检测：使用上海小海龟科技有限公司的BioDigital·青数字化PCR仪，以及人类EGFR（19del/L858R）、EGFR（T790M）检测试剂盒（批号1863103，1863104，863105，江苏圣极基因科技有限公司），按照数字PCR系统及试剂盒说明书操作，检测EGFR基因的突变情况，并对检测结果进行分析与统计。

1.3 观察（评价）指标。分析两种检测方法EGFR基因突变结果，以及dPCR法检测EGFR基因突变丰度结果[5]。

1.4 统计学分析。本研究采用SPSS 18.0统计软件对本文数据进行分析，计量资料用（±s）表示，采用t检验，计数资料用百分比表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ARMS法与dPCR法检测EGFR基因突变结果。ARMS法共检出22例患者，dPCR法共检出26例患者，其中双突变患者分别为3例与6例，见表2。

表2 两种检测方法EGFR基因突变结果

2.2 dPCR法检测EGFR基因突变丰度结果。进行EGFR TKI抑制剂治疗的患者中，p.T790M位点检出6例，未进行治疗的患者均未检出该位点突变；所有EGFR的突变病例中，突变丰度≥1%的突变位点有23个，占总突变位71.88%（23/32），突变丰度＜1%，占28.12%（9/32）；接受TKI治疗的患者T790M突变数为6例，丰度＜1%为4例，比例为66.67%（4/10），见表3。

表3 dPCR法检测EGFR基因突变丰度结果

3 讨论

近年来非小细胞肺癌诊疗在临床已经有了一定进步，患者一旦确诊后，需要根据组织学与突变信息进行分类，再依据治疗指南投药；对于靶向药物研究方面进展，适合进展期患者，在选择药物的时候能够更加贴合患者实际情况[6]。而对肺癌患者进行病理组织样本检测，对后期治疗具有重要意义，可是实际工作中受到多种因素的影响，会使得检测出现一定影响[7]。随着我国外周血循环肿瘤EGFR检测的发展，临床医师也希望有更方便（外周血循环肿瘤DNA）及灵敏度更好（dPCR）的方法，来达到更好的治疗提供更好的临床结果及愈后，因此对检测方式的要求也在不断提高[8]。

芯片式数字PCR（dPCR）能提供更精准的检测结果（绝对定量，精确度达0.01%）、更低的单次开机成本（单次检测样本通量高）、检测费用可控制，血液样本可动态监测，同时也因为提高了患者的治疗效益而获益，见表4。

表4 dPCR法与ARMS法检测EGFR基因突变对比

本文通过将两种检测方法纳入研究，结果显示：ARMS法共检出22例患者，dPCR法共检出26例患者，其中双突变患者分别为3例与6例。能够看出dPCR法检出率较好，本文通过选择3主要突变位点，在传统PCR扩增前，对样品进行微滴化处理，扩增技术后通过直接计划的方法计算平均浓度[9]。由于dPCR法敏感性较高，暂无其他可靠的方法验证，是否存在假阳性仍存在一定争议。突变丰度≥1%的突变位点占总突变位71.88%（23/32），突变丰度＜1%占据28.13%（9/32）；接受治疗的患者中，突变丰度＜1%比例为66.67（4/10）。虽然ARMS法也能够检出部分突变丰度＜1%的突变位点，但仍有部分低丰度突变的患者无法检出，因此在检测外周血EGFR基因突变后，尤其是TKI治疗后的患者，可用dPCR法检出更多低丰度突变的患者，使得更多患者更好的接受靶向治疗[10]。与临床使用的ARMS法相比，dPCR法检测理论上精确度更好，选择ARMS法检测，判读结果期间需要结合多种因素，包括患者耐受性，医生及时与患者沟通，为了确保结果可靠更需要重复进行验证[11]。

但本文研究样本数较少，仅仅选取2年的患者进行研究，可能会使得研究结果出现一定偏差，后期临床需要扩大样本数量，结合dPCR可绝对定量的优点，对基因突变丰度检测，为靶向治疗提供重要依据[12-13]。

综上所述，非小细胞肺癌血液EGFR突变检测期间，使用dPCR法检测准确度较高，灵敏度高，能够更好地指导临床用药，但在检验期间存在一定影响因素，因此需要规范化操作，确保患者更好进行治疗。