基于CaMkkβ/AMPK通路介导线粒体自噬探讨敛肝熄风止颤方的神经保护机制

王春玲 罗宁 蒋媛静 蒙冰 左曜玮 李昌海 文晓东

摘要 目的：觀察敛肝熄风止颤方对帕金森病（Parkinson Disease，PD）的影响，探讨其神经保护机制。方法：将60只SD大鼠分为假手术组10只，造模组50只，造模组大鼠接受PD模型制备，将成模的40只大鼠随机分为模型组10只、低剂量组（0.36 g/kg）10只、中剂量组（0.72 g/kg）及高剂量组（1.44 g/kg）10只，持续灌胃给药30 d，比较各组大鼠阿扑吗啡诱导旋转次数、圆筒实验，纹状体超微结构以及CaMkkβ、AMPK、p-AMPK水平的变化。结果：1）敛肝熄风止颤方可明显减少大鼠转圈以及肢体碰壁的次数，随着剂量增加次数减少更明显，差异有统计学意义（P<0.05）。2）造模大鼠纹状体线粒体自噬现象减弱，敛肝熄风止颤方可明显促进脑组织线粒体自噬。3）中药干预后大鼠纹状体CaMkkβ、p-AMPK蛋白表达上调，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中高剂量组较低剂量组上调明显，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：敛肝熄风止颤方对帕金森病具有神经保护作用，其机制之一可能是通过激活CaMkk/AMPK通路活性促进线粒体自噬有关。

关键词 帕金森病;敛肝熄风止颤方;机制;线粒体;自噬;神经保护;CaMkkβ/AMPK通路

Study on the Neuroprotective Mechanism of Lianggan Xifeng Zhichan Formula Based

on Mitochondrial Autophagy Mediated by CaMkkβ/AMPK Pathway

WANG Chunling1，LUO Ning2，JIANG Yuanjing2，MENG Bing2，ZUO Yaowei1，LI Changhai1，WEN Xiaodong2

（1 College of Pharmacy，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China; 2 Department of

Neurology，Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530011，China）

Abstract Objective：To observe the effect of Lianggan Xifeng Zhichan Formula （LGXFZC） on Parkinson′s disease （Parkinson′s disease，PD） and explore its neuroprotective mechanism.Methods：A total of 60 SD rats were divided into a sham operation group （n=10） and a model group （n=50）.The rats in the model group were made by PD model.40 rats were randomly divided into a model group （n=10），a low dose group （0.36 g/kg） （n=10），a middle dose group （0.72 g/kg） and a high dose group （1.44 g/kg） for 30 days.The rotation times of apomorphine，cylinder test，ultrastructure of striatum and the levels of CaMkk β，AMPK and p-AMPK were compared in each group.Results：1） LGXFZC could significantly reduce the frequency of rotation and limb touching wall in rats.As the dose increases，the frequency decreases more obviously.The difference was statistically significant （P<0.05）.2） the phenomenon of mitochondrial autophagy in striatum of model rats was weakened，and LGXFZC could obviously promote mitochondrial autophagy in brain tissue.3） after the intervention of Chinese medicine，the expression of CaMkk β and p-AMPK protein in the striatum of rats was significantly higher than that in the model group （P<0.05），and compared with the model group，the difference is statistically significant （P<0.05）.Among them，the high-dose group and the lower-dose group were up-regulated significantly （P<0.05）.Conclusion：LGXFZC has neuroprotective effect，and one of its mechanisms may be that it promotes mitochondrial autophagy by activating the activity of CaMkk/AMPK pathway.

Keywords Parkinson′s disease; Linggan Xifeng Zhichan Formula; Mechanism; Mitochondria; Autophagy; Neuroprotection; CaMkk β/AMPK pathway

中图分类号：R289.5;R741文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.05.015

帕金森病（Parkinson Disease，PD）是临床常见的神经退行性疾病，以黑质-纹状体多巴胺能神经元进行性丢失为主要病理学改变[1]，严重影响患者的日常工作和生命质量。因此，寻找安全有效的治疗PD手段，是神经医学及康复医学迫切需要解决的课题。线粒体自噬是清除/降解受损线粒体的过程，是有效阻断受损线粒体导致细胞死亡的关键[2-3]。另一方面，线粒体自噬过程中产生脂肪酸、氨基酸等小分子物质将重新参与机体组织细胞的物质代谢，有研究显示帕金森病的发生发展与线粒体自噬减弱关系密切，调控线粒体自噬对治疗PD多巴胺能神经元损伤有重要的意义[4-5]。

敛肝熄风止颤方首载于《伤寒论·厥阴病》，有敛肝熄风、养血濡筋的作用，临床显示将该方用于治疗PD，确具有一定的疗效[6]，但其机制仍需进一步研究。本研究利用PD大鼠模型对该方治疗PD的作用机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

50只雄性SD（Sprague Dawley）大鼠纳入研究，体质量230～260 g，平均体质量（240±10.50）g，均购自凯学生物科技（上海）有限公司（注册号91310120MA1HK1JC5H），饲养于无特定病原体动物（SPF）级别的动物实验室，饲养环境为12 h/12 h昼夜交替，温度（22±1）℃，湿度（50±2）%。动物的处置符合实验动物伦理学原则。

1.1.2 药物

敛肝熄风止颤方药物组成如下：乌梅20 g、黄连3 g、白芍20 g、当归10 g、熟附子10 g、熟地黄10 g、何首乌20 g、川芎10 g、葛根20 g、人参10 g、石菖蒲5 g、天麻10 g、龟甲10 g、炙甘草3 g。由本院药房统一煎制，熬成100 mL药液。生药均购于本院药剂科并由其提供正品鉴定。

相当于药材量10倍的蒸馏水浸泡30 min，开始时用水量高过药面2～5 cm。煮沸后，文火30 min，用纱布过滤，倒出药汁，再将药材量8倍水倒入药材中，煮沸后，文火30 min，将2次的药汁合并，浓缩至1.06 g/mL。大鼠灌胃药液的剂量按照人/鼠公斤体质量的等效剂量计算。

1.1.3 试剂与仪器

6-OHDA（Sigma公司，美国，货号：28094），CaMkk一抗抗体（CST公司，美国，货号：12716T），AMPK一抗抗体（CST公司，美国，货号：9158S），p-AMPK一抗抗体（CST公司，美国，货号：5759S），一抗抗体（CST公司，美国，货号：4970T），碱性磷酸酶标志物（上海远慕科技有限公司，货号：ym-c0311P-AP），酶标自动分析仪（BIO-BAD公司，美国，型号：Centrifuge MiniSpin），电泳槽（Bio-rad，美国，型号：1658033），转膜仪（Bio-rad，美国，型号：165-800），脱色摇床（Leica，德国，型号：S6E），凝胶成像系统（Bio-rad，美国，型号：GELDoc Go），PCR扩增仪（Bio-rad，美国，型号：T100），电子分析天平（Leica，德国，型号：SECURA225D-1CN）等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

分组：研究将60只SD大鼠分为假手术组10只，造模组50只，造模组大鼠接受PD模型制备，将成模的40只大鼠随机分为模型组10只、低剂量组（0.36 g/kg）10只、中剂量组（0.72 g/kg）10只及高剂量组（1.44 g/kg）10只。

模型制备[7]：参照文献中的PD模型制备方法进行复制，具体如下：利用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）对大鼠进行充分麻醉后固定于脑立体定位仪上，准确定位左侧纹状体，将6-OHDA（5 μg/μL）注射至左侧纹状体，随后常规缝合皮肤，术后常规给予庆大霉素肌内注射预防感染，假手术组大鼠仅接受切开皮肤后缝合处理。造模术14 d对大鼠进行旋转行为测试。造模成功标准：大鼠恒定右转，转速≥7 r/min，30 min内转圈次数>150 r/min。

1.2.2 给药方法

根据人/鼠公斤体质量的等效剂量计算方法，本研究的敛肝熄风止颤方生药量为7.5 g/kg，去药渣合并药液后对药汁进行浓缩，利用婆梅氏比重计对浓缩后药汁的浓度进行测量，使最终药液浓度为1.06 g/mL。随后对中药组大鼠进行低剂量（0.36 g/kg）、中剂量（0.72 g/kg）、高剂量（1.44 g/kg）敛肝熄风止颤汤，分别相当于按人和动物体表面积比率换算的临床等效剂量的1/2、1、2倍，各给药组灌胃给药，假手术组及模型组大鼠接受等容积生理盐水干预。1次/d，各组均连续干预30 d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 APO诱导下转圈次数

造模成功后及药物干预30 d后大鼠腹腔注射APO（0.5 mg/kg），注射10 min后计算大鼠30 min向右侧的转圈次数。

1.2.3.2 圆筒实验

造模成功后及药物干预30 d各组随机抓取3只大鼠置于透明有机玻璃圆筒中，装置大小约20 cm×30 cm，圆筒前置一镜子，记录大鼠左前肢与左后肢与筒壁接触次数，并根据参考文献计算肢体碰壁比率，如左前肢碰壁比率=（a+c）×0.5/（a+b+d）。a：左前肢接觸筒壁的次数。b：单只前肢保持接触筒壁，另一只前肢接触筒壁次数及双上肢同时接触筒壁的次数。c：双上肢同时接触筒壁的次数。d：右前肢接触筒壁的次数。

1.2.3.3 透射电镜观察纹状体线粒体结构

干预结束后各组随机抓取3只大鼠左侧纹状体修剪成大小1 cm3后置于电镜固定液，固定48 h后利用PBS样本漂洗3次后置于1%锇酸和0.2 mol/L PBS 1∶1的缓冲液，在室温条件下后固定1.5 h，继续漂洗3次后用梯度乙醇脱水，脱水结束后将样本置于包埋剂中充分浸透后用环氧树脂包埋样本，手工修切将样本切成超薄切片后用醋酸双氧铀+柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察，拍片。

1.2.3.4 Western Blotting法检测各组纹状体CaMkkβ、AMPK、p-AMPK蛋白浓度的变化

取大鼠3只/组纹状体脑组织200 mg加1 mL裂解缓冲液，4 ℃，15 000 r/min，离心，冰浴中超声，20 s/次，间隔20 s，共5次，1 h取上清，取25 μL测蛋白含量。BCA法测蛋白浓度，用凝胶加样缓冲液将各管蛋白浓度调为一致（2 mg/mL），取20 μL样品煮沸5 min。电泳（5%浓缩胶，12%分离胶，60 V，40 mA，2.5 h）结束后将凝胶取出，进行转膜，遵循胶在负极，膜在正极的原则，100 V，250 mA，时间依据各指标分子量大小而定，将硝酸纤维素膜取出，5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗3次，每次5 min，分别加入抗CaMkkβ、AMPK、p-AMPK、β-actin一抗抗体孵育，4 ℃过夜TBST洗2次，每次5 min，加入辣根过氧化物酶标记与一抗相人如抗的二抗IgG（1∶2 000）室温50 min，TBST洗3次，每次5 min。将滤膜放入配好的显色液中反应1 min，采用Tanon软件拍摄图像并进行半定量分析。

1.3 统计方法

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析处理，本研究采集的数据用均数±标准差（±s）表示，计量资料用多因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组行为学的改变

经过造模后大鼠转圈以及肢体碰壁的次数明显增加，利用敛肝熄风止颤方干预后大鼠肢体碰壁的次数减少，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），并随着敛肝熄风止颤方剂量增加，次数减少越明显（P<0.05）。见表1、表2。

2.2 各组超微结构变化

假手术组大鼠纹状体细胞器结构完整，线粒体嵴明显，未出现断裂现象，细胞核形态正常，核膜完整;模型组组织出现明显空泡病变，线粒体嵴断裂明显，染色体流式明显，细胞器溶解明显;敛肝熄风止颤方干预后组织受损情况较模型组改善，部分线粒体嵴出现断裂，程度较模型组改善，糖原分布交不均匀，且高剂量组较低剂量组改善明显。见图1。

2.3 各组纹状体CaMkkβ、AMPK、p-AMPK蛋白浓度的变化

造模后大鼠纹状体体CaMkkβ、p-AMPK蛋白表达明显减少，与假手术组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。中药干预后大鼠纹状体CaMkkβ、p-AMPK蛋白表达上调，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中高剂量组较低剂量组上调明显，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2、表3。

3 讨论

自噬是机体正常的细胞代谢过程，是用来降解的功能受损/失调的细胞器、多余的细胞质内容物或错误折叠的蛋白质，该过程在真核生物生理或病理过程均可见到[8-10]。线粒体自噬是机体清除功能受损线粒体的唯一途径，以减少呼吸活动和降低膜电位的途径对线粒体的完整性进行维持，此过程中机体活性氧簇的分泌减少，确保细胞内线粒体有足够的能量供应。文献[11-13]显示PD的发生发展与线粒体的自噬密不可分。线粒体的自噬受到诸多生物因素的调控，其中CaMkkβ/AMPK通路是目前已知的与线粒体关系密切的信号通路之一。CaMKKβ是AMPK特有激酶，可将AMPK激活，一旦AMPK被激活后可间接活化TSC2，从而抑制其下游蛋白mTOR的活性，促进自噬。研究显示，CaMkkβ/AMPK通路介导线粒体自噬过程[14-16]，一旦CaMkkβ/AMPK通路被激活则促进细胞的自噬能力。因此，某种干预措施如果可激活CaMkkβ/AMPK通路，则可提高细胞的自噬能力，从而改善PD病情。本研究复制PD模型，利用透射电镜对纹状体组织细胞的超微结构进行观察，结果显示经过模型组大鼠纹状体组织细胞的自噬能力确明显增加，破坏了线粒体结构的完整性，同时利用Western Blotting手段检测了CaMkkβ/AMPK通路蛋白的表达水平，可知模型组大鼠纹状体的CaMkkβ、p-AMPK表达均被抑制，这进一步验证了PD发生时确伴随纹状体组织细胞线粒體自噬能力的减弱，同时出现CaMkkβ/AMPK通路的被抑制。

PD属于中医学“颤证”范畴，从中医角度认为颤证的病位在厥阴，肝和心包的脏腑经络气化乃该病之基础。足厥阴肝经与手厥阴心包经是两阴交尽，一阳初生之地，肝藏血，在体合筋，正如《素问·经脉别论》云：“食气入胃，散精于肝，淫气于筋。”肝血充足则筋得其所养，肝血匮乏则筋脉失养，拘急痉挛，肝肾亏虚阴风内动，同气相求则震颤抖动，故发为本病[17-18]。敛肝熄风止颤方首载于《伤寒论》，方中乌梅为君药，本品来“补肝之猛将”，是养肝柔筋之良药，肝补而阴风不起;龟甲可滋阴潜阳，何首乌和熟地黄共奏补益肝肾、固精生血之功效;白芍可滋阴柔肝，天麻润而不燥，主入肝经，长于平肝息风，凡肝风内动、头目眩晕之症，不论虚实，均为要药。当归、川芎可行气补血活血，葛根可解肌舒筋通络。PD病程日久，虚实寒热错杂，人参大补元气，扶正祛邪，黄连清热。诸药合用肝肾双补，祛风柔筋，使得肝肾精血得补，阴阳平衡得以调整，髓海充盈，祛风柔筋止颤。本研究利用敛肝熄风止颤方干预PD模型鼠，结果显示敛肝熄风止颤方可明显抑制线粒体自噬能力，抑制CaMkkβ/AMPK通路过度激活，从而改善PD模型鼠的行为学能力。

总之，通过实验研究我们认为敛肝熄风止颤方对具有神经保护作用，其机制之一可能是通过激活CaMkk/AMPK通路活性促进线粒体自噬有关。

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（2019-11-30收稿 责任编辑：杨觉雄）

基金项目：广西卫生厅立项项目（Z2016220）;广西中医药大学2018年广西一流学科建设项目重点课题（2018XK089）

作者简介：王春玲（1974.12—），女，博士，讲师，研究方向：神经变性疾病的药理研究，E-mail：osgsssdg@163.com

通信作者：文晓东（1973.02—），男，博士，副主任医师，科主任，研究方向：帕金森病的中西医防治，E-mail：21643438@qq.com