miR-503、PKD1在非小细胞肺癌患者外周血中的表达及临床意义

吴艳丽 熊艳 芦爽 孙厚斌

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常见的组织学类型，腺癌和鳞癌是NSCLC最常见的两种病理类型，近年来NSCLC发病率不断增高，已成为全球范围内致死率最高的肿瘤[1]。肺癌因为在早期阶段并无显著的临床特点和症状，也没有特异性强的检测手段，很多肺癌患者在确诊时已处于发展阶段，进而使治疗效果和预后受到严重影响[2]。为了预防和控制可能的NSCLC发生，检测NSCLC的生物标志物至关重要，因此要改善NSCLC的诊断准确性。研究发现，微小RNA-503(microRNA-503，miR-503)在NSCLC和肝细胞癌中表达显著下调，也可通过靶向原纤维蛋白-1促进糖尿病足溃疡患者的伤口愈合[3-5]。蛋白激酶D(Protein kinase D，PKD)是一种新发现的钙离子/钙调蛋白依赖性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其中蛋白激酶D1(Protein kinase D1，PKD1)是PKD家族研究最深入的成员，在细胞增殖、凋亡、侵袭等一系列生物学行为中起重要调控作用[6]。Wei等[7]研究发现，PKD1在NSCLC患者的癌组织中显著上调，可能是miR-503的直接靶标。经MirTarBase网站预测，miR-503与PKD1存在结合位点，因此本研究通过检测NSCLC患者血清中miR-503、PKD1表达水平，分析两者对NSCLC诊断的临床意义，以期为NSCLC的临床诊断提供一定参考。

资料与方法

一、一般资料

收集2016年1月～2018年1月在本院经病理诊断并确诊的NSCLC患者61例(试验组)，另选取同期体检人群61例作为对照组。两组患者年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。根据国际肺癌研究协会第八版肺癌TNM分期标准，将患者分为I+Ⅱ期43例，Ⅲ期18例[8]。NSCLC患者纳入标准：①有明确的病理诊断结果的NSCLC患者(符合《中国常见恶性肿瘤诊治规范·第六分册·原发性支气管肺癌》[9])，首次治疗或既往治疗结束1个月以上；②具有可测量病灶；③患者有完整的临床资料；④同意遵守医嘱并签署知情同意书者。排除标准：①合并心、肝等严重疾病；②有系统性免疫缺陷症的患者；③儿童、孕妇和精神病患者；患有脓毒症、支气管肺炎等炎症性疾病。本研究经本院道德伦理委员会批准通过，所有样品采集均取得患者及家属知情同意并签字，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

表1 两组一般资料比较

二、主要试剂和仪器

低温高速离心机、Nano Drop 2000(美国Thermo Scientific公司)，荧光实时定量PCR仪(美国Applied biosygtems公司)，Trizol试剂(美国Invirotrogen公司)，逆转录试剂盒(北京天根生物科技公司)，SYBR Premix Ex Taq TM试剂盒(大连TaKaRa公司)，-80℃超低温冰箱(美国Thermo公司)，Milli-Q超净水净化系统(美国Millpore公司)，引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。

三、方法

1 样本采集与保存

所有病理及对照组人员均于清晨空腹抽取外周静脉血5 mL，静置30 min，室温3000 rpm/min，离心15 min，吸取上清液分别装入EP管中，置于-80℃ 冰箱中保存备用。

2 实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测对照组及试验组血清中miR-503、PKD1 mRNA表达

按照Trizol法提取对照组及试验组血清样本中总RNA，分光光度计测总RNA纯度及浓度，根据逆转录试剂盒说明将RNA反转录为cDNA。参照SYBR Premix Ex Taq TM试剂盒说明书进行qRT-PCR反应，以U6、GAPDH基因为内参，miR-503、PKD1、U6、GAPDH引物序列(见表2)。反应条件为：95℃，10 min；40 个PCR循环(95℃，10 s；60℃，60 s，72℃，15 s)。采用2-ΔΔCt方法计算NSCLC患者血清中miR-503、PKD1 mRNA相对表达量。

表2 qRT-PCR引物序列

四、统计学分析

采用统计学软件SPSS 22.0进行数据分析。计量资料以平均数±标准差描述，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；计数资料以[n(%)]描述，行卡方检验。采用Pearson法分析NSCLC患者血清中miR-503、PKD1 mRNA表达的相关性；受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic，ROC)曲线评估血清中miR-503、PKD1 mRNA表达水平对NSCLC的诊断价值。当P<0.05时，代表差异有统计学意义。

结 果

一、NSCLC患者血清中miR-503、PKD1 mRNA在对照组及试验组中的表达

检测结果显示，与对照组相比，试验组miR-503表达水平降低，PKD1 mRNA表达水平升高，二者差异有统计学意义(P<0.05)(见表3)。

表3 miR-503、PKD1 mRNA在对照组及试验组血清中的表达

二、NSCLC患者血清中miR-503、PKD1 mRNA表达水平与临床病理特征的关系

以miR-503、PKD1 mRNA表达水平平均值为界值，分为miR-503、PKD1 mRNA低表达组和高表达组。miR-503、PKD1 mRNA表达水平与年龄、性别、分化程度无关，差异无统计学意义(P>0.05)；与组织学类型、淋巴结转移、TNM分期有关，差异有统计学意义(P<0.05)(见表4)。

表4 miR-503、PKD1 mRNA表达水平与临床病理特征的关系[n(%)]

三、miR-503 、PKD1 mRNA表达水平的相关性

Mirtarbase网站预测，miR-503与PKD1存在结合位点，Pearson法分析结果显示，试验组中miR-503 、PKD1 mRNA表达呈负相关(r=-0.597，P<0.05)(见图1、2)。

图1 miR-503与PKD1结合位点

图2 miR-503 、PKD1表达水平的相关性

四、血清中miR-503、PKD1 mRNA表达水平对NSCLC的诊断价值

血清中miR-503、PKD1 mRNA联合检测诊断NSCLC的曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.861，敏感度为82.0%、特异性为85.2%(见表5、图3)。

表5 血清中miR-503、PKD1 mRNA表达水平对NSCLC的诊断价值

图3 血清中miR-503、PKD1 mRNA诊断NSCLC的ROC曲线分析

讨 论

肺癌在我国癌症中发病率和死亡率均居于首位，每年肺癌发病人数约78.1万，死亡人数约62.6万[10]。肺癌的病理分型中NSCLC约占总数的85%，由于在早期缺乏明显特异性症状，同时易发生血行转移，大多数患者在确诊时已进入中晚期阶段，治疗效果及预后不佳[11]。近年来，随着肺癌早期筛查技术的普及和治疗方式的发展，截止到2015年，我国男性肺癌患者病死率下降了45%，女性肺癌患者病死率下降了19%[12]。对于早期肺癌患者，癌细胞尚未转移，外科手术切除癌症组织为最佳治疗方式。对于肺癌分期预后较差的患者，需要采取辅助化疗、靶向治疗、免疫治疗等提高生存率。因此，肺癌的早期筛查、诊断和治疗对于提高患者的生存率、延长患者寿命十分重要。

近年来研究发现，miR-503与多种癌症的发生发展有关，其在甲状旁腺癌和肾上腺皮质癌中过表达[13-14]；在肾上腺癌中，表达上调与患者的总体生存期缩短有关[14]。PKD1基因位于人类染色体14q11位置，在人体内脑、心脏、肺等多个器官中广泛表达，同时其在维持心肌细胞功能和心血管系统健康及免疫调节方面起到关键作用[15]。Liu等[3]证实miR-503在NSCLC患者组织样本中表达下调，且miR-503异常低表达与患者预后不良有关，是预后不良的独立危险因素。近年来研究发现，PKD1在多种肿瘤中表达异常，如在前列腺癌、乳腺癌胃癌和胃癌中显著下调[16]，而过表达PKD1在胰腺癌、皮肤癌的发展中起重要作用[17-18]。本研究发现，与对照组相比，试验组血清中miR-503表达水平降低，PKD1 mRNA表达水平升高，差异有统计学意义。本研究通过miRtarbase网站预测，miR-503与PKD1存在结合位点。经Pearson法分析，NSCLC患者血清miR-503 、PKD1 mRNA表达呈负相关，提示在NSCLC发展过程中，miR-503、PKD1 mRNA可能存在负反馈调节机制，而miR-503表达水平的降低和PKD1 mRNA表达水平的升高可能加剧了NSCLC的疾病进展。本研究结果显示，miR-503、PKD1表达水平与年龄、性别、分化程度无关，差异无统计学意义；与组织学类型、淋巴结转移、TNM分期有关，差异有统计学意义。提示二者表达水平受到疾病的进程影响，也暗示二者参与了NSCLC的发展过程中。ROC曲线分析发现，miR-503、PKD1诊断NSCLC均具有良好的敏感度及特异性，血清中miR-503、PKD1 mRNA联合检测诊断NSCLC的AUC为0.861，敏感度为82.0%、特异性为85.2%，两者联合诊断价值更高。提示miR-503、PKD1可能共同参与了NSCLC患者的疾病发生发展过程，两者均具有较高的临床价值，联合检测诊断价值更高。

综上所述，miR-503 在NSCLC患者血清中低表达，PKD1高表达，二者呈负相关，均可能与NSCLC的发生发展有关，联合检测对临床诊断具有一定参考意义。本研究也存在研究样本数量偏少，研究深度不够的不足，miR-503、PKD1在NSCLC患者体内的作用机制有待进一步研究。