lncRNA UNC5B-AS1靶向miR-300影响非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭

贾静 吴建 金媛

肺癌已经成为中国癌症死亡的主要原因。其中，80%以上肺癌病例为非小细胞肺癌，与小细胞肺癌比较，非小细胞肺癌细胞的生长和分裂速度更快，对邻近组织的侵袭和远端转移更早[1]。此外，超过50%非小细胞肺癌患者在确诊时已处于肿瘤晚期，其5年生存率低于15%[2-3]。然而，非小细胞肺癌发病机制并不完全清楚。因此，探究非小细胞肺癌发生、转移的分子机制，寻找可靠诊断和治疗靶点是当前亟待解决的重大问题。近年转录组和非编码RNA表达谱研究表明，长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lnRNA)以多种方式调控原癌基因或抑癌基因表达，参与包括非小细胞肺癌在内的多种癌症的肿瘤生长、侵袭、转移和耐药过程[4]。不协调同源基因5B反义RNA1(uncoordinated gene 5B antisense RNA1，UNC5B-AS1)在结肠癌和甲状腺癌细胞和临床样本中表达上调，下调其表达可抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭[5-6]。生物信息学分析显示，miR-300是UNC5B-AS1的潜在靶基因，miR-300已被证实在非小细胞肺癌中发挥抑癌基因作用[7]。然而，UNC5B-AS1在非小细胞肺癌中的表达、生物学功能以及UNC5B-AS1能否靶向miR-300参与肺癌进展仍有待证明。本研究以miR-300为切入点，探讨UNC5B-AS1在非小细胞肺癌中的生物学功能和其分子机制，以期为非小细胞肺癌分子治疗提供新的靶点。

资料与方法

一、实验材料

A549细胞购于中国典型培养物保藏中心；杜尔伯科改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)培养液、胎牛血清、Lipofectamine 2000购于美国Invitogen公司；逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq购于大连TAKARA生物技术有限公司；UNC5B-AS1小干扰RNA(si-UNC5B-AS1)、无序列阴性对照(si-NC)、miR-300模拟物(miR-300mimics)、mimics阴性对照(miR-NC)、miR-30抑制物(anti-miR-300)、抑制物阴性对照(anti-miR-NC)、PCR引物、UNC5B-AS1野生型(WT-UNC5B-AS1)或突变型(MUT-UNC5B-AS1)荧光素酶报告基因载体由上海吉玛制药公司提供；Transwell小室购于美国corning公司；四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)试剂、放射免疫沉淀测定(Radioimmunoprecipitation assay，RIPA)缓冲液、聚偏二氟乙烯膜购于上海碧云天生物公司；兔源细胞周期素D1(CyclinD1)、p21、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、MMP-9、磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体、山羊抗兔IgG为美国Abcam公司。

二、组织来源

本研究选取2015年1月至2017年6月于我院进行手术的30例非小细胞肺癌患者(病理类型为鳞癌12例，腺癌10例，腺鳞癌8例；病理分期为T1期15例、T2期9例、T3期6例，N0期13例，N1期10例，N2期7例，均为M0期)，其中男性22例，女性8例，年龄38岁至72岁之间。所有患者术前未接受放疗、化疗和其他抗肿瘤治疗，术中收集肿瘤组织和癌旁组织。本研究得到了医院医学伦理委员会的批准，所有患者在术前签署知情同意书。

三、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测A549细胞中UNC5B-AS1和miR-300的表达

采用Trizol试剂从癌组织、癌旁组织中分离总RNA。利用逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，引物序列如下：UNC5B-AS1上游5′-GATCCTGCCTCAGGGAAA-3′,下游5′-GCTCAAGAGGTTGGGACT-3′；GAPDH上游5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′,下游5′-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′；miR-300上游5′-TATACAAGGGCAGACTC-TCTCT-3′；U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′利用SYBR Premix Ex Taq在ABI PRISM 7500荧光定量PCR仪上进行实时PCR分析。采用2-ΔΔCt法计算UNC5B-AS1和miR-300的相对表达水平。

四、细胞培养

细胞复苏后，采用含10%胎牛血清的DMEM的培养基于37 ℃、CO2体积分数5%的细胞培养箱中培养A549细胞，按照1 ∶2比例每两天换液一次，当细胞融合至80%时进行传代，去对数期细胞用于实验。

五、细胞转染和实验分组

将对数期A549细胞按2×105cells/接种于6孔板，当细胞融合度达到60%时进行瞬时转染。利用Lipofectamine 2000将si-NC、si-UNC5B-AS1、miR-NC、miR-300 mimics、si-UNC5B-AS1 + anti-miR-NC、si-UNC5B-AS1 + anti-miR-300分别转染A549细胞，依次命名为si-NC组、si-UNC5B-AS1组、miR-NC组、miR-300组、si-UNC5B-AS1 + anti-miR-NC组、si-UNC5B-AS1 + anti-miR-300组。转染48 h时，收集细胞检测转染效果合格后进行后续实验。

六、 MTT法检测A549细胞增殖活力

将各组A549细胞按照5×105cells/孔，100 μL/孔接种到96孔板，每组设置3个复孔，培养24、48、72 h后按照20 μL/孔加入质量浓度为5 g/L的MTT溶液，37 ℃继续孵育4 h，按照150 μL/孔加入DMSO试剂，振荡10 min使其充分溶解结晶，酶标仪于490 nm处检测各孔的吸光度值。

七、 Transwell实验检测A549细胞迁移和侵袭能力

侵袭实验：转染48 h，收集各组A549细胞，消化后用无血清DMEM培养液制备单细胞悬液。取100 μL细胞悬液加入到包被基质胶的Transwell上室；取500 μL含10%胎牛血清的DMEM培养液作为化学引诱剂加入24孔板下室。在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h，用棉签擦去Transwell上室未迁移细胞，磷酸盐缓冲液冲洗后，用甲醇、结晶紫溶液分别对下室膜进行固定和染色。随机选取3个视野，进行细胞计数，其均值即为侵袭细胞数。采用未包被基质胶的Transwell小室进行迁移实验，其他步骤同侵袭实验。

八、Western blot检测A549细胞CyclinD1、P21、MMP-2和MMP-9蛋白表达

采用RIPA缓冲液提取各组A549细胞总蛋白，BCA法测定其浓度。取30 μg蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将分离的细胞蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%的脱脂牛奶溶液封闭膜后，加入稀释的一抗溶液(MMP-2和MMP-9为1 ∶500，CyclinD1和P21为1 ∶1 000，GAPDH为1 ∶2 000)室温条件孵育膜1 h，洗膜后，加入稀释的二抗溶液(1 ∶2 000)室温条件孵育膜1 h。洗膜后，加入化学发光试剂显影。采用目的蛋白与内参蛋白GAPDH灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。

九、统计学分析

结 果

一、lncRNA UNC5B-AS1和miR-300在肺癌组织中的表达

肺癌组织中UNC5B-AS1的表达水平较癌旁组织显著升高，miR-300的表达较癌旁组织显著降低(P<0.05)(见表1)。

表1 lncRNA UNC5B-AS1和miR-300在肺癌组织中的表达

二、抑制lncRNA UNC5B-AS1表达对A549细胞增殖的影响

与si-NC组比较，si-UNC5B-AS1组A549细胞UNC5B-AS1的表达显著降低，提示A549细胞中UNC5B-AS1的表达受到抑制。与si-NC组比较，si-UNC5B-AS1组A549细胞活力、CyclinD1蛋白表达显著降低，p21蛋白表达显著升高(P<0.05)(见表2、图1)。

表2 抑制lncRNA UNC5B-AS1表达对A549细胞增殖的影响

图1 增殖相关蛋白表达

三、 抑制lncRNA UNC5B-AS1表达对A549细胞迁移侵袭的影响

与si-NC组比较，si-UNC5B-AS1组A549细胞迁移和侵袭细胞数、MMP-2和MMP-9蛋白表达显著降低(P<0.05)(见表3、图2)。

表3 抑制lncRNA UNC5B-AS1表达对A549细胞迁移侵袭的影响

图2 迁移侵袭相关蛋白表达

四、 miR-300过表达对A549细胞增殖、迁移侵袭的影响

与miR-NC组比较，miR-300组A549细胞miR-300的表达水平显著升高，提示已成功上调A549细胞miR-300表达。与miR-NC组比较，miR-300组A549细胞在48、72 h细胞活力、迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达显著降低，p21蛋白表达显著升高(P<0.05)(见表4、图3)。

表4 miR-300过表达对A549细胞增殖、迁移侵袭的影响

图3 增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

五、 lncRNA UNC5B-AS1靶向调控miR-300的表达(LncBase Predicted v.2)

采用生物信息分析工具LncBase Predicted v.2在线分析显示，UNC5B-AS1与miR-300之间存在部分连续互补的核苷酸序列(见图4)。双荧光素酶报告实验显示，上调miR-300表达可降低WT-UNC5B-AS1荧光素酶报告载体的荧光素酶活性(P<0.05)，而对MUT-UNC5B-AS1活性无显著影响(见表5)。与pcDNA组比较，pcDNA-UNC5B-AS1组A549细胞miR-300的表达水平显著降低；与si-NC组比较，si-UNC5B-AS1组A549细胞miR-300的表达水平显著升高(P<0.05)(见表6)。

图4 lncRNA UNC5B-AS1的序列中含有与miR-300互补的核苷酸序列

表5 双荧光素酶报告实验

表6 lncRNA UNC5B-AS1调控miR-300的表达

六、抑制miR-300表达逆转了抑制lncRNA UNC5B-AS1表达对A549细胞增殖、迁移侵袭的作用

与si-NC组比较，si-UNC5B-AS1组A549细胞miR-300的表达水平显著升高，细胞活力、迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达显著降低，p21蛋白表达显著升高；与si-UNC5B-AS1+anti-miR-NC组比较，si-UNC5B-AS1+anti-miR-300组A549细胞miR-300的表达水平显著降低，细胞活力、迁移和侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达显著升高，p21蛋白表达显著降低(P<0.05)(见表7、图5)。

表7 抑制miR-300表达逆转了抑制lncRNA UNC5B-AS1表达对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭的作用

图5 增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

讨 论

近年来，非小细胞肺癌发病率和死亡率呈升高趋势，已成为威胁人们健康的公共卫生问题[8]。lncRNA是多种生物学过程的关键调控因子，大量证据表明，lncRNA的异常表达在肿瘤进展中起着重要作用[4]。因此，探索与非小细胞肺癌增殖、转移相关的lncRNA，将为临床非小细胞肺癌治疗提供新的靶点。

研究显示UNC5B-AS1在甲状腺乳头状癌中表达上调，并参与决定组织学肿瘤类型，通过检测UNC5B-AS1和RP11-547D24.1表达还可区分PTC不同分期甲状腺乳头状癌患者[9]。通过对癌症基因组图谱数据的基因表达谱交互分析，发现UNC5B-AS1在卵巢癌组织样本、细胞中也呈高表达，其通过组蛋白甲基化转移酶2(Histone methyltransferase 2，EZH2)调控N-myc下游调控基因2(NDRG2)上的组蛋白H3在赖氨酸27(H3K27me)甲基化，促进卵巢癌进展，UNC5B-AS1功能缺失将阻碍卵巢癌细胞增殖，促进卵巢癌细胞凋亡[10]。本研究通过RT-qPCR检测UNC5B-AS1在肺癌组织中表达发现，肺癌组织中UNC5B-AS1的表达较癌旁组织显著升高，提示UNC5B-AS1可能参与肺癌恶性进展。于是本研究通过功能缺失实验检测证实UNC5B-AS1的生物学功能，结果显示抑制UNC5B-AS1表达可降低A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力，与前人报道UNC5B-AS1的致癌作用相一致[5-6]。Cyclin D1和P21是调节细胞周期进展和细胞增殖的关键蛋白，Cyclin D1上调、P21下调促进肿瘤恶性进展[11]。MMP-2和MMP-9可降解细胞外基质，促进肿瘤细胞浸润周围组织、扩散转移[12]。本研究显示抑制UNC5B-AS1表达后，Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表达显著降低，P21蛋白表达增加，与功能分析实验结果相符。提示，抑制UNC5B-AS1通过下调Cyclin D1、MMP-2和MMP-9表达，上调P21表达进而抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭。

lncRNA通过与特定的miRNA结合降低其表达水平，减轻其对靶基因的抑制作用是其参与调控肿瘤进展的重要机制[13-14]。已有研究发现，lncRNA Gm15290通过与肿瘤抑制因子miR-615-5p直接相互作用，促进肺癌细胞的增殖和侵袭[15]。lncRNAMAGI2反义RNA3(MAGI2-AS3)通过靶向miR-374a/b-5p抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[16]。本研究中miR-300被选定为UNC5B-AS1的潜在靶基因。探究miR-300在肺癌中作用发现，肺癌组织中miR-300表达下调，过表达miR-300可降低A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力，与前人研究结论一致[7]。此外，miR-300在口腔鳞状细胞癌、肝癌也表达下调，过表达miR-300抑制癌细胞的增殖和转移[17-18]。进一步分析UNC5B-AS1和miR-300之间关系发现，miR-300是UNC5B-AS1的靶基因，且上调UNC5B-AS1可抑制miR-300表达，下调UNC5B-AS1则促进miR-300表达。此外，恢复实验显示，抑制miR-300表达可逆转抑制UNC5B-AS1对A549细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制作用。提示UNC5B-AS1直接通过靶向抑制抑癌基因因子miR-300表达，来促进A549细胞的增殖、迁移和侵袭。

综上所述，UNC5B-AS1在非小细胞肺癌中发挥癌基因作用。抑制UNC5B-AS1通过上调miR-300可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭。因此，UNC5B-AS1有望成为非小细胞肺癌分子治疗的新靶点。