慢性阻塞性肺疾病患者IL-6、IL-8、TNF-α水平与支气管黏膜自噬的相关性分析

王萌萌 於海洋 孙雨晴 程朋朋 汪倩 管雯斌 韩锋锋

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Diseases，COPD，简称慢阻肺)是一种常见的慢性呼吸系统疾病，全球40岁以上发病率高达9% ～10%[1]。慢阻肺因其高发病率、高致死率和高经济负担的特点，现已成为严重的世界性公共卫生问题[2]。探究慢阻肺的发病机制，对研发其药物靶向治疗具有重要意义。研究表明慢阻肺是一种全身炎症反应综合征，特别是急性加重期，包括CRP、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α在内的炎性介质均会升高[3]。同时也有研究表明自噬与慢阻肺的发生发展有着密切关系，我们的前期研究已发现慢阻肺患者肺组织自噬水平在轻、中度组增强，重度组减弱[4]。本文通过检测慢阻肺患者血清和BALF中炎症因子及支气管黏膜组织中自噬相关基因及蛋白的表达水平，分析其二者在慢阻肺疾病进展中的作用。

资料与方法

一、实验对象及分组

研究对象选自2016 年6月1日至 2019年10月1日期间收治于上海交通大学医学院附属新华医院呼吸科的慢阻肺稳定期患者以及同期健康体检者。本研究经过上海交通大学附属新华医院伦理委员会批准，并通过受试对象的知情同意。实验对象分为3组：慢阻肺患者分为A和B组，A组(轻度+中度组)(n=12)、B组(重度+极重度组)(n=8)，以及对照组(n=10)，组间患者的性别比例和病情严重程度等一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)。其中，慢阻肺组诊断标准按照2017年慢性阻塞性肺疾病国际诊治指南[5]，依照肺功能检查评估气流受限严重程度，慢阻肺患者肺功能FEV1/FVC均<70%，轻度FEV1≥80%预计值，中度50%≤FEV1<80%预计值，重度30%≤FEV1<50%预计值，极重度FEV1<30%预计值，将慢阻肺患者分为轻度、中度、重度、极重度(其中轻度n=6、中度n=6、重度n=7，极重度n=1)。排除已明确诊断以下疾病及禁忌症的患者：支气管炎，活动性肺结核，间质性肺疾病，肺栓塞，慢性血栓栓塞性肺动脉高压，严重肝、肾功能不全，严重心血管疾病，神经肌肉疾病，脑梗死或脑出血后遗症，有支气管镜检查禁忌症。

二、实验材料

TNF-α、IL-6、IL-8试剂盒购自Elabscience公司。Atg5、P62引物合成(上海生物工程有限公司)、逆转录试剂盒[TakaRa]。微管相关蛋白1轻链3( microtubule associa-ted protein 1 light chain-3B，LC3B)抗体、P62抗体购自Abcam，Beclin1抗体购自CST。GAPDH抗体、辣根过氧化物酶山羊抗兔(二抗)、辣根过氧化物酶山羊抗小鼠(二抗)购自碧云天。

三、试验方法

1 肺功能检测 采用意大利科时迈肺功能仪(COSMED 公司产)测定3组受试者的第一秒用力呼气量占预计值百分比(FEV1/预计值%)、肺活量占预计值百分比(FVC/预计值%)、FEV1/FVC(%)。

2 酶联免疫吸附法ELISA检测血清、肺泡灌洗液中炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α 于清晨空腹抽肘正中静脉血5 mL，支气管电子内镜系统BF290(OLYMPUS 公司产)下收集肺泡灌洗液5 mL，2层无菌纱布过滤待离心，外周血及肺泡灌洗液均3 800 r/min转速离心15 min，取上清置于-80 ℃冰箱保存待测。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清及肺泡灌洗液IL-6、IL-8、TNF-清，所有操作严格按试剂盒说明书进行。

3 免疫组织化学染色 支气管镜下收集患者支气管黏膜组织约15 mg，操作按SABC免疫组织化学试剂盒说明进行。烘片、脱水、3% H2O2灭活、抗原修复、5%牛血清清蛋白(BSA)封闭，30 min后孵兔抗人LC3B抗体4 ℃冰箱过夜，羊抗兔二抗室温孵育30 min，加入试剂SABC室温孵育20 min，DAB显色试剂盒显色。苏木素复染、脱水、透明、封片，显微镜下观察、照相。

4 实时荧光定量real-time PCR检测人肺组织中Atg5、P62的mRNA表达 支气管镜下收集患者支气管黏膜组织约15 mg与1 mL Trizol相混合后放入组织匀浆器中充分研磨，RNA分离提取后，反向转录成cDNA，采用SYBR Green以cDNA为模板进行实时荧光PCR反应；反应参数：95 ℃ 30 s 1个循环，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s 40个循环，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s ，15 s 1个循环，样本目的基因的计算公式为2-ΔΔCt。以GAPDH为内参照，人GAPDH上游引物CAGGAGGCATTGCTGATGA，下游引物GAAGGCTGGGGCTCATTT，人Atg5上游引物TGGACAGTTGCACACACTAGGA，下游引物TCAGATGTTCACTCAGCCACTG；人P62上游引物TGGCCATGTCCTACGTGAAG，下游AGCCATCGCAGATCACATTG。

5 Western blot测定支气管黏膜自噬相关蛋白Atg5、Beclin1、LC3B的表达 支气管镜下收集患者支气管黏膜组织约15 mg与300 μl蛋白裂解液(RIPA裂解液 ∶PMSF=100 ∶1)混合后加入匀浆器中，充分研磨，转移入1.5 mL EP管超声粉碎，冰上裂解30 min，以14 000 r/min离心20 min后取上清，用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测样品蛋白浓度。12% SDS-PAGE凝胶80 V电泳120 min，转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(1 ∶1 000稀释)孵育4 ℃过夜。一抗复温30 min，二抗(1 ∶1 000稀释)孵育40 min，发光剂显影成像。结果用Image LabTM软件进行灰度值分析。

四、统计学处理

结 果

一、实验对象临床资料的一般性描述

A组、B组与对照组性别比例和病情严重程度等一般资料相比，性别差异无统计学意义(P>0.05)，A组、B组FEV1/预计值%明显低于对照组(P<0.001)(见表1)。

表1 实验对象临床资料的一般性描述

二、人血清和肺泡灌洗液上清中IL-6、IL-8及TNF-α的表达

与对照组相比，血清炎症因子A组没有统计学意义，B组中IL-6、IL-8及TNF-α表达明显增高，有统计学意义(IL-6的P<0.05，IL-8、TNF-α的P<0.01)。肺泡灌洗液上清A组IL-6表达明显升高，有统计学意义(P<0.05),B组中IL-6、IL-8及TNF-α表达明显增高，有统计学意义(IL-6的P<0.05，IL-8的P<0.001、TNF-α的P<0.05)(见图1、2)。

图1 血清炎症因子IL-6、IL-8及TNF-α的表达(与对照组比较，*P<0.05， **P<0.01)

图2 肺泡灌洗液上清炎症因子IL-6、IL-8及TNF-α的表达(与对照组比较，*P<0.05, ***P<0.001)

三、支气管黏膜组织免疫组化LC3B染色

与对照组相比，A组、B组患者支气管黏膜组织的LC3B蛋白表达量减少(见图3)。

图3 支气管黏膜组织LC3B蛋白免疫组织化学(HE ×200)

四、自噬相关基因Atg5、P62的mRNA表达

Real-time PCR结果分析显示Atg5在A组、B组mRNA显著低于对照组(其中A组、B组P<0.001)，P62在A组、B组mRNA显著高于对照组(其中A组、B组P<0.001)(见图4)。

图4 支气管黏膜组织Atg5、P62的 mRNA基因表达

五、自噬相关蛋白Beclin1、P62、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达

Western blot分析结果显示， Beclin1在A组、B组蛋白表达显著低于对照组(其中A组P<0.001，B组P<0.001)。P62在A组、B组蛋白表达显著高于对照组(其中A组P<0.001，B组P<0.001)。LC3B在A组、B组蛋白表达显著低于对照组(其中A组P<0.01，B组P<0.001)(见图5)。

图5 支气管黏膜组织Beclin1、P62、LC3B的蛋白表达

六、炎症因子水平与自噬作用的相关性分析

与正常对照组对比，随着疾病严重程度的进展LC3B蛋白表达量与血清IL-8水平呈负相关(r=-0.001，P<0.01),与肺泡灌洗液IL-8水平呈负相关(r=0.022，P<0.01),与血清、肺泡灌洗液IL-6、TNF-α水平无相关性(见表2、3)。

表2 血清炎症因子IL-6、IL-8、TNF-症与LC3B蛋白表达量的相关性分析

表3 肺泡灌洗液炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α与LC3B蛋白表达量的相关性分析

讨 论

慢阻肺患者炎症的发生及发展与多种炎症细胞活化及炎症因子和介质的释放有关，气道和肺部对有毒颗粒及气体的炎症反应增强是慢阻肺最主要的发病机制[5]。慢阻肺的慢性炎症主要累及气道、肺实质和肺血管，其中中性粒细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞参与慢性炎症的发生和发展，这些细胞激活后释放包括IL-6、IL-8、TNF-α在内的多种炎症介质[6]。IL-6是一种具有多种生物活性的趋化因子，因其具有激活和调节免疫细胞等生理特性，可以通过促进B细胞的成熟，分泌IgG、IgE、IgA等细胞因子，从而诱导炎症反应参与多种疾病的发生发展过程。有研究表明慢阻肺患者血清IL-6和肺泡灌洗液中巨噬细胞、中性粒细胞水平显著升高[7]。IL-8是一种多细胞源性的炎症因子，具有多种生物效能，中性粒细胞与IL-8接触后可发生形态变化，胞内Ca+浓度升高脱颗粒，外周血组胺释放增加引发炎症反应参与调节疾病的关键病理改变，此外IL-8对淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞也有一定作用，在慢阻肺疾病病理中IL-8可诱导气道炎症反应和气道重塑[8]。TNF-α可以激活中性粒细胞和巨噬细胞，以增加其细胞毒性作用，释放更多IL-6、IL-8等细胞炎性因子，进而加快炎症反应进程[9-10]。本研究结果显示慢阻肺患者血清IL-6、IL-8、TNF-α水平高于对照组，提示在慢阻肺患者的肺组织和气道中存在炎症反应和气道重塑，这为临床预测慢阻肺患者疾病严重程度提供了理论依据。

细胞自噬作为一种新的细胞程序性死亡方式，是维持细胞内环境自稳的一种重要保护机制，是通过溶酶体介导的降解细胞内受损蛋白质或者细胞器的代谢及更新过程[11-12]。自噬参与慢阻肺疾病的气道重塑、肺气肿和血管重塑等病理过程，随着疾病的不断进展，自噬保护作用逐渐减弱[13]。气道重塑是慢阻肺发展过程中的一个重要特征，病理表现为纤毛减少、缺失和运动障碍，杯状细胞增多，支气管黏膜假复层纤毛柱状上皮鳞化，纤维结缔组织等增生并伴炎性细胞浸润；随着疾病的进展，后期还可出现细小支气管管壁胶原化，终末细支气管远端异常扩张进而导致肺气肿[14]。慢阻肺早期可见血管内皮细胞受损、管壁增厚，随着疾病不断进展血管平滑肌增厚、胶原纤维增多和炎性细胞浸润，近年来研究发现自噬与血管重塑亦关系密切[15]。最新研究表明细胞自噬与炎症反应密切相关，固有免疫系统利用胚系基因编码的模式识别受体T0LL样受体(toll-like receptors，TLR)、NOD样受体(nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLR)的激活能够诱导细胞自噬的发生，而细胞自噬对炎症反应又有精细调控作用，以避免过度的炎症反应对有机体的损害与刺激[16-17]。同时细胞自噬与抗感染免疫密切相关，而细胞自噬的缺损是诱发炎症反应和炎症性疾病的一个重要因素，细胞自噬能通过促进凋亡细胞的清除而弱化炎症反应[18-21]。本研究结果显示轻度+中度组、重度+极重度组，较对照组自噬作用显著减弱，且有递减趋势，提示在慢阻肺疾病的进展中随着疾病的严重程度不断加重，自噬的保护作用逐渐降低，这为我们临床上减缓慢阻肺疾病进展和改善预后提供了新思路。

本研究以慢阻肺患者(轻度+中度组、重度+极重度组)与非慢阻肺体检者为实验对象，与对照组相比，轻度+中度组、重度+极重度组血清、肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、TNF-α显著升高，提示血清、肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、TNF-α水平与慢阻肺患者严重程度密切相关，可能参与了慢阻肺疾病的发展过程，并且IL-6、IL-8、TNF-α水平升高表明炎症反应增强，可能对慢阻肺患者的生存质量造成负面影响和作用。因此，检测患者血清、肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、TNF-α水平对慢阻肺严重程度的临床诊疗、预后评估都有一定的指导意义。此外，本研究结果发现随着慢阻肺患者疾病严重程度不断加重，与对照组相比，轻度+中度组、重度+极重度组慢阻肺患者支气管黏膜Beclin1、LC3B Ⅱ的蛋白表达量在慢阻肺轻度+中度组、重度+极重度组蛋白表达显著低于对照组，P62的蛋白表达量在慢阻肺轻度+中度组、重度+极重度组蛋白表达显著高于对照组。Atg5的mRNA基因表达量在慢阻肺轻度+中度组、重度+极重度组显著低于对照组，P62的mRNA基因表达量在慢阻肺轻度+中度组、重度+极重度组显著高于对照组。结果提示轻度+中度组、重度+极重度组自噬作用显著减弱，不难推断在慢阻肺疾病演变过程中，自噬的保护作用逐渐降低，并参与了慢阻肺疾病的发展过程，患者支气管黏膜组织降解胞质内受损的结构及细胞器的能力逐渐减弱，细胞在应激状态下代谢产生游离脂肪酸、氨基酸等营养物质需要的能量逐渐减少，从而进一步加重病情。自噬基因参与凋亡通路，当表达降低，凋亡基因可表达增加，从而诱导细胞发生凋亡，肺功能逐渐降低，导致疾病严重程度逐渐加重。更重要的是，支气管黏膜自噬作用与血清以及肺泡灌洗液中IL-8水平呈负相关，提示IL-8可能与自噬作用的调控有关，两者之间的相互作用可能在慢阻肺疾病的进程中，也扮演了不可忽视的角色。

随着慢阻肺疾病严重程度逐渐加重，炎症反应明显增强，炎症因子水平的升高可能与自噬功能受损有关，但目前具体机制尚未完全明确，有待我们进一步去探明。因此了解慢阻肺疾病发生、发展的相关机制对于正确评价慢阻肺的疾病状态，寻找与疾病急性加重发作频率、进展、预后的相关指标及临床诊治具有重要意义。