妊娠期糖尿病中细胞因子信号传导抑制蛋白-3过表达对滋养细胞增殖与凋亡的作用研究

刘晶晶，刘莹*，李玉珍

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指在妊娠期间出现不同程度的葡萄糖耐受不良，从而导致的高血糖代谢疾病[1]。据统计，约10%左右孕妇患有GDM，且其发病率逐年增加[2]。由于胎盘激素的抗胰岛素作用，孕妇脂肪组织增加和胰岛素抵抗被认为是引起GDM的主要因素，GDM的进一步发展将会增加妊娠期其他并发症的发生率，且妊娠后患糖尿病的风险也越来越高[3]，严重威胁产妇与婴儿的健康。

细胞因子信号传导抑制蛋白-3(suppressor of cytokine signaling-3,SOCS-3)是细胞因子信号传导抑制蛋白家族成员，由细胞产生并反馈性阻断细胞因子信号转导过程，参与多种细胞因子、生长因子和激素的信号调节[4]。SOCS-3可以抑制白细胞介素-1受体(interleukin-1 receptor,IL-1R)、肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNF-R)可溶性蛋白和白细胞介素-6受体(interleukin-6 receptor，IL-6R)信号通路[5]。研究表明，SOCS-3及其这些负性调节因子与GDM的发生发展密切相关[6]。本研究通过探讨 SOCS-3在 GDM胎盘组织的表达情况，以及过表达SOCS-3对滋养细胞增殖与凋亡能力的影响，为靶向治疗GDM奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 临床资料采集

选取 2018年6月至 2019 年12 月于西安市第四医院妇产科住院分娩的GDM患者 50例和同期健康孕妇50例。所有孕妇均为单胎，均因不同原因实施剖宫产手术分娩，无其他病史，均签署知情同意书。GDM患者均符合世界卫生组织 GDM 诊断标准。待胎盘娩出后，取母体中央胎盘脐带根部组织1 cm×1 cm×1 cm大小块，注意避开出血、坏死与钙化区域，使用PBS溶液漂洗后，一部分置于液氮中快速冷冻后，保存于-80℃冰箱中，另一部分固定于10%甲醛中。

1.2 主要材料与试剂

人绒毛膜滋养层细胞株HTR-8/SVneo细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。引物和pCR 3.1/SOCS-3载体均由上海生工生物公司构建合成。10%胎牛血清、青霉素/链霉素与DMEM培养基均购自美国Gibco公司，Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Hyclone公司，Trizol试剂盒、cDNA合成试剂盒与SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒购自美国Thermo Scientific公司，CCK-8 试剂盒和AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，RIPA细胞裂解液、BCA蛋白检测试剂盒与发光液ECL购自上海碧云天生物技术有限公司，0.1%结晶紫染色液和免疫组化染色试剂购自北京雷根生物技术有限公司，SOCS-3、GAPDH一抗与辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗购自美国Abcam公司。

1.3 免疫组织化学染色检测细胞因子信号传导抑制蛋白-3表达

将固定好的胎盘组织进行常规石蜡包埋，切成厚度为4 μm的薄片，脱蜡至水后，滴加2% 乙二胺四乙酸(EDTA)溶液高温下进行抗原修复，使用3% H2O2去除内源性过氧化物酶。滴加兔抗SOCS-3(1∶200)在4℃过夜，次日PBS 冲洗，滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG(1∶1 000)，室温下孵育1 h，PBS 冲洗后，DAB 显色，苏木精复染，中性树胶封片，在电镜下观察，组织中特异性淡黄色、棕黄色颗粒即为阳性表达。

1.4 细胞培养、分组与转染

在HTR-8/SVneo细胞中加入含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗的DMEM培养基，置于37℃、5% CO2培养箱内培养。将对数生长期的细胞以1×105个/孔接种于六孔板中孵育过夜，待细胞长满瓶底50%～70%时进行转染。将细胞随机分为3组：空白对照组、空质粒转染组与SOCS-3 质粒转染组。根据Lipofectamine 2000试剂说明操作，分别将构建好的pCR 3.1 空质粒载体与pCR 3.1/SOCS-3载体转染至空质粒载体转染组与SOCS-3 质粒转染组细胞中，在37℃、5% CO2培养箱中培养，次日换液，继续培养72 h 后收集细胞。

1.5 实时荧光定量PCR检测细胞因子信号传导抑制蛋白-3 mRNA表达

使用Trizol试剂提取GDM患者和健康孕妇胎盘组织及各处理组HTR-8/SVneo细胞的总RNA。按照cDNA合成试剂盒说明进行逆转录合成cDNA，采用SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒进行qRT-PCR 检测SOCS-3 mRNA表达，以β-actin为内参基因。扩增条件包括95°C 5 min(1个循环)；95°C 30 s， 60°C 15 s， 72°C 30 s(40个循环)。采用2-ΔΔCt法计算SOCS-3 mRNA相对表达量。使用引物序列如下：SOCS-3上游引物5′-CAGATCCACGCTGGCTCC-3′，下游引物5′- CGGTTGGACTTCTTGTTG-3′，β-actin上游引物:5′-CCTGGCACCCAGCACGCTTC-3′，下游引物:5′- GCCGATCCACACGGAGTAC-3′。

1.6 Western blot 检测细胞因子信号传导抑制蛋白-3蛋白表达

在各处理组HTR-8/SVneo细胞中加入RIPA细胞裂解液，提取细胞的总蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。以每孔30 μg蛋白的量上样，进行10% SDS-PAGE 电泳，将分离蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，滴加兔抗SOCS-3(1∶200)与内参GAPDH(1∶1 000)抗体，4℃孵育过夜，TBST洗膜，滴加HRP标记山羊抗兔IgG(1∶1 000)，室温孵育2 h，TBST 洗膜后，滴加化学发光液ECL 显色，凝胶成像系统中曝光，采用Image J图像分析软件分析各条带灰度值。

1.7 CCK-8 检测细胞活性

各处理组HTR-8/SVneo细胞以2×104个/孔接种至 96 孔板，在37℃、5% CO2细胞培养箱中培养24、48、72 h后分别取出细胞，在每孔中加入10 μL CCK-8溶液，轻轻混匀，继续孵育 2 h，根据CCK-8 试剂盒说明，在酶标仪上450 nm处检测各孔细胞光密度(OD)。

1.8 流式细胞术检测细胞周期分布

将各处理组HTR-8/SVneo细胞用 PBS 洗涤，使用预冷的75%乙醇重悬后在-20℃下固定24 h，PBS再次洗涤并重悬细胞，每组取 450 μL 细胞悬液，加2 μL RNase后，37℃下孵育 10 min，接着加500 μL 碘化丙啶(PI)，置于37℃下避光孵育30 min，过300 目筛网，通过流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.9 Annexin V-FITC/PI染色、Hoechst 33342染色检测细胞凋亡

将各处理组HTR-8/SVneo细胞以1×105个/孔接种于6孔板过夜培养，使用胰蛋白酶消化后收集， PBS洗涤细胞。根据Annexin V-FITC试剂盒进行细胞凋亡检测，加入500 μL 1×Binding Buffer重细胞，接着加入5 μL Annexin V-FITC结合液与10 μL PI混匀，室温避光孵育15 min，立即通过流式细胞仪上机检测细胞凋亡情况。

将各处理组HTR-8/SVneo细胞使用4% 多聚甲醛固定过夜，以0.5% Triton×100透化15 min，PBS洗涤细胞，滴加终浓度5 μg/mL Hoechst 33342染色，室温避光孵育30 min，PBS再次洗涤，脱水后中性树胶封片，使用荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 胎盘组织中细胞因子信号传导抑制蛋白-3表达检测

qRT-PCR检测 SOCS-3 mRNA在50例GDM患者与50例健康孕妇胎盘组织中表达的结果显示，SOCS-3 mRNA在GDM患者胎盘组织中的表达水平高于健康孕妇，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

注：*表示GDM患者与健康孕妇胎盘组织比较，P=0.001。

免疫组化染色检测GDM 患者与健康孕妇胎盘组织中SOCS-3蛋白表达， SOCS-3在健康孕妇胎盘组织中阳性表达率为(8.42±1.03)%，GDM患者胎盘组织中SOCS-3阳性表达率为(30.70±2.87)%，两组比较差异有统计学意义(P=0.001)，见图2。

2.2 pCR3.1/细胞因子信号传导抑制蛋白-3转染效率鉴定

qRT-PCR与Western blot 检测结果显示，与空白对照组相比，在 pCR3.1/SOCS-3 转染的HTR-8/SVneo细胞中，SOCS-3 mRNA及蛋白的表达量显著升高，差异有统计学意义(P=0.001、0.002)；而空质粒转染组较空白对照组细胞中SOCS-3 mRNA及蛋白的表达量比较差异无统计学意义(P=0.751、0.544)，见图3。提示 SOCS-3 基因转染成功。

注：A：空白对照组；B：空质粒转染组；C：SOCS-3 质粒转染组。与空白对照组比较，*P<0.05。

2.3 过表达细胞因子信号传导抑制蛋白-3对HTR-8/SVneo细胞增殖的影响

CCK-8检测过表达SOCS-3对HTR-8/SVneo细胞增殖能力的影响，与空白对照组比较，SOCS-3 质粒转染组的HTR-8/SVneo细胞转染后培养细胞24 h、48 h和72 h，细胞增殖活性显著下降，差异有统计学意义(t=8.762、8.758、10.029；P=0.003、0.003、0.001)；空质粒转染组与空白对照组细胞的增殖活性比较差异无统计学意义(t=0.585、0.311、0.629；P=0.405、0.411、0.560)，详见表1。

表1 各组HTR-8/SVneo细胞活性比较

空白对照组空质粒转染组SOCS-3 质粒转染组图4 流式细胞术检测细胞比例分布

2.4 过表达细胞因子信号传导抑制蛋白-3对HTR-8/SVneo细胞周期分布的影响

流式细胞术检测过表达SOCS-3对HTR-8/SVneo细胞周期分布的影响，与空白对照组比较，SOCS-3 质粒转染组的S期细胞比例升高而G1期细胞比例下降，差异有统计学意义(t=35.786、40.878；P=0.001、0.001)；空质粒转染组与空白对照组G1期、S期和G2期细胞比例比较，差异均无统计学意义(t=0.452、0.358、0.401；P=0.726、0.803、0.719)，见图4、下页表2。

表2 各组HTR-8/SVneo细胞周期分布比较

2.5 过表达细胞因子信号传导抑制蛋白-3对HTR-8/SVneo细胞凋亡的影响

Annexin V-FITC/PI检测过表达SOCS-3对HTR-8/SVneo细胞凋亡影响，与空白对照组比较，SOCS-3 质粒转染组的HTR-8/SVneo细胞凋亡率升高，差异有统计学意义(P=0.001)；空质粒转染组与空白对照组的细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(P=0.801)，见图5。

注：A：空白对照组；B：空质粒转染组；C：SOCS-3 质粒转染组。*与空白对照组比较， P<0.05。

Hoechst 33342染色检测结果同样显示，空白对照组和空质粒转染组HTR-8/SVneo细胞细胞核外围轮廓较清晰，细胞大小较为一致，未见明显的细胞核浓缩、碎裂等凋亡现象。而SOCS-3质粒转染组的HTR-8/SVneo细胞出现细胞核核固缩、碎裂和溶解的现象，说明细胞出现凋亡，见图6。

3 讨论

胎盘作为联系母婴的重要器官，其发育情况是妊娠的重要影响因素[7]。人胎盘滋养细胞是胎盘的主要组成成分，在胎盘的发育过程中，位于母胎屏障最外层的胎盘滋养层细胞会分泌大量激素和细胞因子，从而对胎盘形成和功能的维持发挥着重要作用[8-9]，滋养细胞功能异常涉及多种妊娠疾病的发生。多项研究表明，维持滋养细胞的正常功能，例如增殖、凋亡、侵袭、分化和血管重塑对于确保胚胎的发育极为重要。

SOCS-3具有阻断信号传导通路的作用，已被证实为JAK/STAT信号转导途径负调节中最关键的因子，SOCS-3表达可以抑制Janus激酶(janus kinase,JAK)与信号转导和转录激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)活性以及信号传导途径中一系列细胞因子的激活，此外，还能够抑制包括脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)以及干扰素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)等产生的信号通路途径[10]。先前已有研究证明，在肝癌、肺癌和乳腺癌等的实体瘤中均检测到SOCS-3低表达，在血液系统恶性肿瘤中也发现了SOCS-3表达下降，并导致了持续性STAT 3磷酸化和抗肿瘤相关基因的低表达[11-12]。而Chatterjee 等[13]通过研究发现，使用匹格列酮治疗糖尿病会明显减少 SOCS-3 的表达，导致患者出现肝炎和胰岛素抵抗的现象。洪小苹等[6]的研究表明，GDM孕妇胎盘和脂肪组织中SOCS-3 mRNA表达量均升高。本研究的结果与此前一致，GDM孕妇胎盘组织中SOCS-3 mRNA和蛋白的表达量均升高。

绒毛外滋养层细胞有助于滋养细胞浸润，使细胞能够逐渐移入子宫螺旋动脉，替换血管内皮和肌肉内膜并扩大血管直径，从而使整个子宫内有足够胎盘界面。所以，胚胎的成功着床、胎盘的形成及胚胎的生长发育，与滋养细胞的增殖、侵袭功能密切相关[13]。本研究结果显示，过表达SOCS-3会抑制滋养细胞的活性，对细胞正常增殖产生影响。当滋养层细胞遭受过度的氧化应激时，大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)积聚，并导致妊娠并发症发生[14]。过量的ROS能够通过线粒体依赖性途径刺激细胞凋亡。研究表明，GDM患者胎盘中滋养细胞异常凋亡会导致胎盘组织生长增加，进而引起胎儿过度发育[15]。本研究结果显示，在HTR-8/SVneo细胞中过表达SOCS-3后，促进了细胞凋亡的发生，由此说明过表达SOCS-3可能会导致滋养细胞增殖能力下降并出现异常凋亡现象。

综上所述，SOCS-3 在GDM患者胎盘组织中高表达，过表达SOCS-3会抑制滋养细胞的增殖活性并促进细胞凋亡，说明SOCS-3与GDM的发生、发展有关，可作为生物学标志为GDM的诊治及预后判断提供理论支持。