SIRT1调控Nrf2信号通路对宫颈癌细胞增殖、凋亡及迁移侵袭的影响

卢霞，许旭

宫颈癌在中国已成为中青年女性的第二大高发恶性肿瘤，每年新发病例占全球病例的28%以上[1]。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT 1)是一种组蛋白去乙酰化酶，是调节细胞应激、诱导细胞凋亡的重要分子[2]。临床研究表明SIRT1随宫颈病变的加重表达升高，对宫颈癌的发生和发展发挥促进作用，且SIRT1表达与宫颈癌的不良临床预后相关；体外实验发现SIRT1在人乳头状瘤病毒(human papilomavirus,HPV)感染的宫颈癌细胞中过表达[3-4]。然而SIRT1促进宫颈癌发生发展的具体作用机制目前尚不明确。核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)信号通路可通过调节机体氧化应激维持细胞的正常生理活动，Nrf2异常激活会引起Nrf2蓄积，导致Nrf2下游产物增多，增加肿瘤细胞对化疗药物的耐受性[5]。有研究发现，Nrf2蛋白在宫颈癌组织和细胞中高表达，上调Nrf2促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，下调Nrf2的表达后可抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡[6]。据报道，SIRT1在细胞氧化还原平衡和抗氧化应激中起重要作用，Nrf2的表达可受到SIRT1的正调控[7]。因此本研究探讨SIRT1调控Nrf2信号通路对宫颈癌细胞增殖、凋亡及迁移侵袭的影响，从分子角度阐述SIRT1促进宫颈癌发生发展的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

宫颈癌细胞株Hela细胞购自美国ATCC、胎牛血清购自美国Gibco公司、RPMI-1640培养基购自北京天润善达生物科技有限责任公司、TRIzol Reagent购自美国Invitrogen公司、SIRT1、Nrf2、NQO1、GAPDH普通PCR上下游引物购自广州华大生物科技有限公司、SYBR Green PCR Master Mix购自TaKaRa、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自Thermo Scientific、RIPA裂解液购自上海申能博彩生物科技有限公司、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo公司、SIRT1单克隆抗体、Nrf2单克隆抗体、NQO1单克隆抗体、HO-1单克隆抗体均购自美国Abcam公司、HRP标记山羊抗兔IgG购自美国Santa Cruze公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组与转染 细胞培养条件：将Hela细胞加入到体积分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37℃，体积分数为5% CO2培养箱培养。将细胞培养至对数生长期即可进行后续实验。

细胞分组：① 空白对照组：每孔细胞加入PBS液；② SIRT1阴性对照组(negative control group，NC组)：每孔细胞转染对照空载体(GFP-SIRT1)；③ SIRT1抑制组：每孔细胞转染SIRT1干扰载体(si-SIRT1)。

1.2.2 Western Blot和qRT-PCR法检测各组细胞SIRT1的表达水平 取对数生长期细胞参照总蛋白提取试剂盒步骤提取各组细胞总蛋白，加入等体积上样缓冲液，沸水浴变性5～10 min。取50 μL变性蛋白样品至SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳。经转膜仪转膜后浸于含5%脱脂奶粉的封闭液中封闭。洗涤后加入抗体(1∶1 000)，4℃孵育过夜，再加入HRP标记的二抗(1∶2 000)常温下孵育2 h。比较各组细胞SIRT1蛋白的相对表达量。

各组细胞按照总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒说明分别提取总RNA及cDNA模板，取1 μL cDNA产物进行qRT-PCR扩增。扩增条件：预变性94℃ 5 min，94℃变性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸30 s。40个循环后72℃维持10 min。引物由广州华大生物科技有限公司设计合成，引物设计如下：SIRT1上游5′-GCAACAAGCATCTTGCCTGAT-3′，下游5′-GTGCTACTGGTCTCACTT-3′；GAPDH上游5′-ACGGCCGCATCTTCTTGTGCA-3′，下游5′-TGCCACTG CAAAT- GGCAGCCC-3′。SIRT1基因的相对表达量按公式(2-△△Ct法)计算，每组实验重复3次。

1.2.3 MTT法检测各组细胞的增殖能力 待细胞数达到1.0×106/mL后更换为无血清RPMI-1640培养基培养24 h。避光条件下每孔加入0.5 mg/mL的MTT，继续培养4 h，弃100 μL上清后每孔加DMSO 100 μL，震荡10 min，分别于0 h、24 h、48 h、96 h检测490 nm处的吸光度(OD值)。

1.2.4 流式细胞术检测各组细胞的凋亡能力及细胞周期 各组细胞培养72 h后收集2×105～5×105细胞加入Binding Buffer液500 μL悬浮细胞，加入Annexin V-FITC 5 μL混匀，加Propidium Iodide 5 μL。室温避光反应10 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡。

将各组细胞于37℃环境中孵育48 h后，使用PBS洗涤细胞2次，加入含量为70%预冷乙醇轻柔吹打混匀细胞后，于4℃环境中固定12 h，使用PBS洗涤细胞2次。取0.5 mL PBS重悬细胞，加入10 μL 7-AAD，同时加入适量RNaseA使其终浓度均为50 mg/L，于37℃环境中温浴30 min后，加400 μL PI避光染色30 min，采用流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.5 细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力 取各组转染后培养48 h的细胞用胰蛋白酶消化，按2×105/孔接种于6孔板，37℃恒温培养过夜，用200 μL高压灭菌枪头垂直于板孔进行划线，用PBS冲洗划出的细胞后加入无血清培养基继续培养，24 h后对划痕处细胞迁移情况进行观察、拍照；划痕宽度用Image-proplus 6.0进行检测。实验重复3次。

1.2.6 Transwell细胞侵袭实验检测各组细胞的侵袭能力 取Matrigel基质胶，用不含胎牛血清的培养液按9∶1进行稀释，平铺于Transwell小室的上室，37℃过夜凝固。取各组转染后培养48 h的细胞用胰蛋白酶消化，调整细胞密度为4×105/mL，取200 μL加入小室的上室，将600 μL含20%胎牛血清的培养液加入下室，37℃培养24 h，取出小室，1%多聚甲醛混合，结晶紫溶液染色15 min，显微镜观察拍照，计数穿膜细胞数。实验重复3次。

1.2.7 Western Blot和qRT-PCR法检测各组细胞Nrf2、NQO1、HO-1的表达水平 具体实验操作步骤同1.2.2。Nrf2上游5′-GGACCTAAAGCACAGCCAACACAT-3′，下游5′-TCGGCTTGAATGTTTGTCTTTTGTG-3′；NQO1上游5′-TGGAAGCTGCAGACCTGGTG-3′，下游5′-TTGTCATA CATGGTGGCATACGTG-3′；HO-1上游5′-CTTTTTTCACC TTCCCGAGCATC-3′，下游5′-GGTCTTAGCCTCTTCTGT CAGGGTGT-3′。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组细胞SIRT1的表达水平比较

与空白对照组和SIRT1 NC组相比，SIRT1抑制组SIRT1 mRNA和蛋白表达水平均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，详见图1。

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与SIRT1 NC组相比，#P<0.05。

2.2 各组细胞的增殖能力比较

与空白对照组和SIRT1 NC组相比，SIRT1抑制组细胞的吸光度值显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，详见图2。

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与SIRT1 NC组相比，#P<0.05。

2.3 各组细胞的凋亡能力及细胞周期比较

细胞凋亡结果显示，与空白对照组和SIRT1 NC组相比，SIRT1抑制组细胞的凋亡能力显著增加；细胞周期结果发现，SIRT1抑制组G0/G1期细胞数明显多于空白对照组和SIRT1 NC组；而SIRT1抑制组S期细胞数明显少于空白对照组和SIRT1 NC组。差异均有统计学意义(P<0.05)，详见下页图3、4。

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与SIRT1 NC组相比，#P<0.05。

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与SIRT1 NC组相比，#P<0.05。

2.4 各组细胞的迁移和侵袭能力比较

细胞划痕实验结果显示，SIRT1抑制组中划痕宽度显著宽于空白对照组和SIRT1 NC组；Transwell 细胞侵袭实验结果发现，与空白对照组和SIRT1 NC组相比，SIRT1抑制组中穿过小室基质胶的细胞数目显著减少。差异均有统计学意义(P<0.05)，详见下页图5、6。

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与SIRT1 NC组相比，#P<0.05。

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与SIRT1 NC组相比，#P<0.05。

2.5 各组细胞Nrf2、NQO1、HO-1的表达水平比较

SIRT1抑制组Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA表达水平[(0.48±0.11)、(0.67±0.09)、(0.53±0.07)]与空白对照组[(1.00±0.15)、(1.00±0.15)、(1.00±0.11)]和SIRT1 NC组[(1.01±0.12)、(0.95±0.14)、(1.00±0.05)]相比均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与空白对照组和SIRT1 NC组相比，SIRT1抑制组Nrf2、NQO1、HO-1的蛋白及mRNA表达水平均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见下页图7。

注：与空白对照组相比，*P<0.05；与SIRT1 NC组相比，#P<0.05。

3 讨论

宫颈癌是一种以肿瘤细胞的持续增生和侵袭、不凋亡为特征的恶性肿瘤，目前对促进肿瘤细胞侵袭及抑制凋亡的细胞机制是研究的热点[7]。研究表明，肿瘤细胞高迁移性和侵袭性是导致复发的重要原因[8]。SIRT1能够涉及到细胞的能量代谢、凋亡以及恶性肿瘤的发生和发展多个方面，其中SIRT1在机体发挥抑制细胞凋亡的作用[9-10]。目前研究显示，SIRT1在肿瘤中过表达，其表达水平越高，肿瘤细胞的凋亡越少，恶性生长特征越明显，侵袭转移增殖等现象增加[11]。有研究发现，miRNA-204可通过下调SIRT1抑制肝癌细胞增殖、促进其凋亡[12]。另有研究发现，miRNA-34a可下调SIRT1的表达从而抑制前列腺癌细胞的增殖，提示SIRT1具有维持前列腺癌增殖的作用[13]。

本研究采用转染SIRT1干扰载体(si-SIRT1)特异性抑制Hela细胞中SIRT1基因的表达，Western Blot和qRT-PCR结果均显示，SIRT1抑制组Hela细胞中SIRT1基因的蛋白和mRNA表达水平均低于空白对照组和SIRT1 NC组，提示Hela细胞中SIRT1基因的表达被成功抑制。MTT结果显示，48 h、96 h后SIRT1抑制组细胞的吸光度值均低于空白对照组和SIRT1 NC组，提示SIRT1参与细胞的增殖过程，下调SIRT1基因的表达可有效抑制细胞的增殖活性。细胞凋亡结果显示，与空白对照组和SIRT1 NC组相比，SIRT1抑制组细胞的凋亡能力显著增加；细胞周期结果发现，SIRT1抑制组G0/G1期细胞数明显多于空白对照组和SIRT1 NC组；而SIRT1抑制组S期细胞数明显减少，提示下调SIRT1基因的表达可使细胞在G1期阻滞，促进细胞的凋亡。细胞划痕实验结果显示，SIRT1抑制组中划痕宽度显著宽于空白对照组和SIRT1 NC组；Transwell 细胞侵袭实验结果发现，与空白对照组和SIRT1 NC组相比，SIRT1抑制组中穿过小室基质胶的细胞数目显著减少，提示特异性抑制细胞中SIRT1基因的表达可有效降低细胞迁移及侵袭能力。

当细胞受到氧化应激、亲电子试剂等刺激后，Nrf2可迅速解离出来并活化转位进入细胞核，与ARE结合进而激活下游靶基因的转录，以保护正常细胞免受氧化应激。但是，高水平的Nrf2在癌症中促进癌细胞生长，具有化学抗性和放射抗性[14]。近年来，越来越多的研究表明Nrf2具有致癌特性，如乳腺癌、肺癌、食管鳞状细胞癌等[15-16]。NQO1是一种黄素酶，在机体的解毒代谢中发挥着重要作用，能维持抗氧化物质的生物活性和还原性[17]。HO-1是热休克蛋白家族中的重要成员，具有抗增殖的作用，在许多疾病中发挥作用[18-19]。有研究发现，宫颈癌组织中Nrf2、HO-1蛋白表达上升，提示在宫颈癌中Nrf2/ARE通路被特异性激活，为宫颈癌的早期干预提供参考依据[20]。焦淑娟等[21]研究发现，维吾尔族宫颈鳞癌组织中存在Nrf2通路的激活，Nrf2基因沉默可能通过调控HO-1抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖、迁移及侵袭能力，并促进细胞凋亡。本研究结果表明，与空白对照组和SIRT1 NC组相比，SIRT1抑制组Nrf2、NQO1、HO-1的蛋白及mRNA表达水平均显著降低，提示抑制细胞中SIRT1基因的表达可降低Nrf2、NQO1、HO-1的表达，从而抑制Nrf2信号通路的活化，在肿瘤的生物学行为中起到一定的作用。

综上所述，SIRT1可促进宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭，抑制其凋亡，其可能的作用机制是SIRT1促进Nrf2信号通路的活化，为临床治疗宫颈癌提供一个新的思路。