卵巢癌中过继性细胞免疫治疗研究进展

黄筱雨，洪莉

卵巢癌是女性生殖系统恶性肿瘤中死亡率最高的类型，其发生率在我国仅次于子宫颈癌和子宫体癌。统计显示卵巢癌的新发数和死亡数约占全部类型的1.6%和1.9%(2018年)，5年生存率仅为47%(2015年)。卵巢癌首选手术和辅助化疗，但大多数晚期患者最终复发。卵巢癌具免疫原性，免疫系统在其发生发展中起重要作用。免疫治疗克服肿瘤异质性，打破免疫抑制和耐受状态，加强识别和杀伤能力。在免疫治疗策略中过继性细胞免疫治疗(adoptive cell immunotherapy,ACT)被认为是最有前途的方法之一。

ACT是将自身或者同种异体免疫效应细胞体外扩增和/或激活再输注。以是否依赖人白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)作用将ACT分为两类：一类依赖HLA通过特异性T细胞受体(T cell receptor,TCR)识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigens,TAA)；另一类则不依赖HLA(详见表1)。前者包括肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)以及T细胞受体改造的T细胞(T cell receptor engineered T cells,TCR-T)，后者则包括天然免疫系统中不依赖HLA的免疫效应细胞如自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)，淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine activated killer,LAK)和细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK)及嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)。CAR直接以单链抗体(single chain antibody fragment,scFv)进行识别，因此为非HLA依赖。多年来基于TLC、NK、LAK、CIK的卵巢癌治疗已有大量研究，而TCR-T和CAR以基因工程为基础，研究门槛高，相关领域有待进一步探索。近年来CAR研究不断推陈出新，在卵巢癌治疗方面具有巨大潜力。

表1 ACT分类及特点

以下就不同类型ACT的特点及研究进展做一概述，为将来ACT治疗卵巢肿瘤方面的研究及应用提供依据。

1 非人白细胞抗原依赖的过继性细胞免疫治疗

1.1 自然杀伤细胞

NK细胞是理想的ACT免疫因子，具有强抗瘤力，细胞亚群少，体内存活短，通过应激诱导配体直接识别靶细胞。研究表明NK细胞毒性和肿瘤内浸润数量与患癌风险和预后显著相关。

NK-ACT研究重在提高数量、活性和靶向性。常用提高活性方法包括细胞因子共培养，改变来源及通过改造增强活性等。细胞因子共培养简单易行，大量研究支持，但方案需进一步探讨。一种与白介素(interleukin,IL)12、15及18短暂预激活的细胞因子诱导的有记忆性的NK细胞能增强干扰素(interferon，IFN)γ释放、提高对卵巢癌的杀伤活性并表现出潜在性规避肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)的能力[1]。IL-15超激动剂复合体甚至增强腹水来源NK活性。抗表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)预处理可提高肿瘤细胞对NK细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)的敏感性，但同时降低分泌细胞因子能力[2]。NK细胞的来源多样，如干细胞、外周血。改变来源可获得更高活性NK，例如“非成体”人多能干细胞来源及在体内和体外均有强抗瘤能力的造血干细胞及祖细胞来源的NK。或许从患者来源扩增筛选更为直接，但如何适应临床应用有待研究。基因改造方面，三抗体形式的双特异性抗体[人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)2x分化群(cluster of differentiation，CD)16]可增强抗肿瘤活性[3]；SESN(sestrins)2和SESN 3上调抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体(mammalian target of rapamycin complex，mTORC)1信号，促进一磷酸腺苷激活的蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK]信号传导进而影响体内外NK-92细胞杀瘤活性[4]。NK细胞与其他免疫细胞[如NK的树突状细胞(dendritic cell,DC)]的编辑功能或者与其他ACT(如CAR-NK)联用也增强抗瘤活性。目前NK-ACT临床应用的瓶颈在于体外扩增技术，关键在于其安全性、短耗时、低成本和高效率。

1.2 细胞因子诱导的杀伤细胞

CIK细胞来源外周血，受CD3抗体、IFN-γ和IL-2刺激产生，特征性表达CD3和CD56，与贝伐珠单抗相比，对耐药型卵巢癌细胞毒性更强。一项细胞实验发现CIK治疗使上清中肿瘤标记物(tumor marker,TM)如糖类抗原(carbohydrate antigen,CA)125、人附睾蛋白(human epididymis protein,HE)4降低，可考虑作为疗效监测指标之一。基于CIK的研究集中于提高杀伤性。一体外实验通过shRNA干扰发现球状癌干细胞样细胞也能通过低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)介导的细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1 ，ICAM-1)下调抵抗CIK介导的细胞裂解[5]，结合在贴壁细胞中得到同样的结论，未来研究考虑通过干预此通路提高CIK抗瘤毒性。CIK联合其他ACT提高抗瘤性。叶酸受体α(folate receptor α,FRα) -CAR改造CIK细胞或者卵巢癌患者月经血来源的DC-CIK细胞增强细胞毒性，同时DC-CIK免疫治疗促进CD4+、CD25+、Treg升高，改善T细胞功能及亚群比例失衡，且免疫因子增殖率、成熟数量、抗瘤力、安全性和可行性均有提高。临床试验中发现CIK联合化疗和/或其他免疫细胞疗效较好，显著降低血清TM，改善凝血。易获取及低成本的来源是临床应用、推广的关键。体外实验证明脐血来源CIK细胞具抗肿瘤活性，临床试验中发现输注脐带血 (umbilical cord blood,UCB) -CIK的卵巢癌患者得到部分缓解[6]。

1.3 淋巴因子激活的杀伤细胞

LAK在卵巢癌治疗方面的研究近年来非常有限。大量临床试验报道高剂量IL-2处理的自体LAK移植临床反应有限，而以腹膜纤维化率为代表的不良反应发生率较高[7]。

1.4 嵌合抗原受体

CAR兼具抗原特异性和细胞活化特性，其胞外结构主要是scFv，胞内信号域是其分类依据。第4代CAR通过编辑入细胞因子基因释放招募第二波免疫细胞对缺少CAR靶标的细胞发起攻击。如分泌IL -18的CAR- T不仅扩增性和持久性增强，还可调节TME[8]。CAR经典载体为T细胞，其他载体可能不良反应更低、疗效更佳，如在细胞实验和动物实验中发现CAR-NK不诱导CRS、不易脱靶、毒性低而且来源广[9]。CAR靶点在提高疗效中起重要作用，许多已进入临床试验阶段[9-13]。尿激酶纤溶酶原激活物表面受体(urokinase plasminogen activator surface receptor,U-PAR)可在非肿瘤性间质细胞表达使靶向间质细胞成为可能，同时另一研究构建基于天然配体受体结合的抗uPAR-CAR，成功降低免疫原性[14]。放化疗在抑制T细胞的同时也使更多靶点暴露，如协同紫杉醇与HER2-CAR-T治疗。除了表面分子标记，还可开发其他靶点。TME严重影响CAR疗效，是实体瘤治疗中难以避免的障碍，但同时提供新靶点；肿瘤外泌体具免疫抑制作用，在卵巢癌的发生发展过程起到重要作用，也可纳入治疗靶点的考虑之中[15-17]。靶标的正确选择可规避不良反应，利用双抗原特异性/可切换双受体或者mRNA编码降低半衰期可降低对正常组织的毒性，设计亲和调节的scFv和单次低剂量的单抗预处理也被认为是潜在策略。CAR制备低成本、高效率及安全性的实现关键在载体细胞来源和制备途径。有研究提出有望大规模生产的诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)-CAR-T以及具有强抗瘤能力的NK-CAR-iPSC-NK细胞作为载体来源。制备途径方面提出了设计简单、使用方便、成本低廉、“非肿瘤”毒性较小的基于RNA的CAR，但大规模转染时效率较低。CAR治疗策略中联合治疗常被提及。IL-2短期共培养产生利于治疗的记忆CAR-T细胞[18]；IL-7和IL-15可促进CAR-T的体外扩增； 一项体内实验发现抑制IL-10可逆转TME的负面影响，从而提高CAR-T的存活率及抗瘤能力[18-19]。此外，多项动物实验发现局部注射比静脉注射更具潜力且可有效改善TME。

2 人白细胞抗原依赖的过继性细胞免疫治疗

2.1 特异性T细胞受体/肿瘤浸润淋巴细胞

TIC/TIL系由肿瘤T细胞分离扩增一反应性CD3+亚群，通过分泌IFNγ和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)α抑制体外肿瘤。TIL分离结果与患者结局间存在相关性。1项临床试验对转移性卵巢癌患者进行TIL联合IL-2治疗，证明其可行性和耐受性，但TIL作用不完全，研究考虑与抑制性免疫检查点通路即淋巴细胞激活基因3 (lymphocyte-activation gene 3 ，LAG3)/MHCII和细胞程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD1)/细胞程序性死亡配体1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)有关[20]。TIL研究存在不良反应、难以标准化分离及难以扩展跨癌症模型以及其识别、杀伤机制尚不明确等障碍。

2.2 特异性T细胞受体

TCR由对患者T细胞受体链进行基因工程设计得到，同CAR-T一样由于识别正常组织中靶点导致“在靶离瘤”毒性及低亲和力导致“离靶离瘤”毒性，故实体瘤治疗中获益有限。近年来研究尝试通过开发靶点、改善受体亲和性、设计合适转染载体及改善TME等途径来解决。

目前TCR靶标可分为癌-睾丸抗原、致癌性病毒抗原和新抗原。新抗原系由非同义突变、标签基因突变或基因融合产生，可触发CD8+T细胞反应，目前已开发可增强并快速识别新抗原的TCRs及高效生产的方法，其有效性也已验证。同时新抗原TCRs的优化和诱导简化研究都强调新表位选择对避免交叉反应的重要性。克服表面抗原的靶向局限性还可考虑正常组织中缺乏表达的胞内靶标。增强TCRs亲和力可增强T细胞特异性和功能性，但高亲和性受体数量少、难识别，可尝试改造互补决定区改变亲和力和亲和度[21]。然而TCRs具超过敏性亲和力阈值，而且高亲和力易导致不良反应，存在自反应性。通过肿瘤内注射提高T细胞局部浓度、加入抑制性分子区分出肿瘤细胞及T细胞诱导自杀开关可能解决以上问题[22]。此外，一种天然高亲和力HLA-A*02:01 (a*02)-限制性TCR可有效靶向纽约食管鳞状细胞癌1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1,NY-ESO-1)细胞系且无交叉反应发生，同时另一研究发现HLA-A*02:01-TCR转导的CATs具相似特性[23]。构建TCR时内源性α和β亚基错配不仅降低其靶向性，还产生新抗原特异性反应。适当的载体设计可减少误配，如利用基因编辑技术消除竞争性内源TCR和干扰PD-1基因[24]。TME阻碍T细胞浸润，可通过TCR-T表达针对肿瘤的细胞因子并结合逆转抑制信号的信号开关来解决，或者通过人工T细胞活化适配分子调节TCR-T信号通路，提高其在TEM中的持久性[22,25]。

3 过继性细胞免疫治疗研究热点

目前提高ACT安全性和有效性的可行策略包括靶点开发、效应细胞基因改造及改善临床治疗策略。靶点是提高ACT靶向性关键，准确靶向对避免 “在靶离瘤”、“离靶离瘤”毒性及提高疗效具重要意义。而以基因改造为基础的CAR和TCR-T愈受青睐，主要由于基因修饰的角度和方法选择范围广[24,26]；也可以基因修饰的造血干细胞作为来源或者编辑入自杀基因开关提高安全性[27-28]；基因修饰效应细胞还可拓展到NK细胞、iNKT细胞、GD型T细胞、iPS细胞等。其中CAR-NK细胞亚群少、生存期短故体外风险低，但有效性及毒副作用有待验证[27]。TME降低ACT效应物激活能力和生存时间，是ACT临床应用中不可避免的障碍。对卵巢癌TME的研究不仅能提供更多靶点，还帮助探寻更优治疗策略及开发早期卵巢癌检测标志物。ACT的联合治疗提高疗效，避免不良反应，改善预后，应用潜力巨大，但临床试验有限，缺乏有力结论。

未来ACT研究不仅应关注基础研究，更应关注临床试验及推广应用中的具体问题：如何避免TME干扰，如何保证免疫效益因子大规模生产的高效性及安全性，如何实现效应因子的制备既满足个性化同时降低成本等。