自体血与纳米碳在大鼠结肠肠壁定位效果的对比实验研究

陈 鹏，张传鑫，郑 鑫，张 旭，郑 博，许安琪，邱润丰，俞 泳

(杭州市临安区第一人民医院 肛肠外科，浙江 杭州 311300)

目前腹腔镜辅助下结直肠肿瘤手术已基本替代传统开腹手术[1]。但是腹腔镜手术尤其是机器人手术中术者无法用手触摸肠管，缺乏力觉反馈[2]，故对较小病灶的结直肠癌或息肉摘除后病理提示局灶癌变需追加手术的患者，存在术中定位困难的问题，从而衍生出众多术前、术中定位的方法。常用定位方法有金属夹定位、染料标记法、腹腔镜超声、手助技术等。最新研究提示将自体血注射到结直肠肠壁来对结直肠病灶部位进行标记是一种操作简单、安全有效又性价比高的方法，可应用于腹腔镜结直肠手术前对病灶的精确定位[3]。由于自体血难免存在自身机化吸收，为了研究自体血定位有效时间，为临床提供定位后手术时机的参考依据，本研究以SD大鼠为模型，对比纳米碳及自体血定位的效果。

1 材料与方法

1.1 分组 SD大鼠(浙江省医学科学院提供)96只，随机分配成生理盐水组4组(A、B、C、D)、纳米碳定位组4组(A1、B1、C1、D1)、自体血定位组4组(A2、B2、C2、D2)，每小组各8只。每小组1～8号分别于不同部位饱和苦味酸+酒精染色及尾部标号以区分。其中生理盐水组为空白对照组，纳米碳组为对照组，自体血组为实验组。

1.2 方法 术前麻醉：按0.4 mL/100 g标准腹腔注射10%水合氯醛麻醉。手术记录：麻醉完全后将大鼠固定于操作板，备皮消毒后取剑突下2 cm前正中偏左1 cm处行约1.5 cm大小切口，小拉钩牵引暴露后用无损伤镊提出大鼠盲肠，以盲肠处粗管型肠管为准，找到升结肠，按分组于升结肠浆膜下肠壁注射0.1 mL生理盐水、纳米碳0.1 mL、自体血0.1 mL，注射处肠系膜3-0可吸收线结扎标记，回纳肠管，连续缝合关腹。每组分别于术后第1、3、5、7天解剖观察、切除及固定标本，并以颈椎脱臼法安乐死(即术后第1、3、5、7天分别观察并处死生理盐水组、纳米碳组及自体血组大鼠各8只)。

1.3 结果观察 各组定位分别后于术后第1、3、5、7天解剖观察标记是否存在：生理盐水组及自体血组观察到定位处淤血或血肿为阳性，否则为阴性(自体血定位术后第1、3、5、7天肉眼观见图1A～D)；纳米碳组观察到定位处残留纳米碳为阳性，否则为阴性(纳米碳定位术后第1、3、5、7天肉眼观见图1E～H)。切除定位处肠管2 cm用10%甲醛固定，并行病理染色，观察病理切片标记是否存在：生理盐水组提示有血肿为阳性，否则为阴性；自体血组提示有血肿为阳性，否则为阴性；纳米碳组提示有异物残留为阳性，否则为阴性。

1.4 数据统计与分析 利用 SPSS 18.0 统计软件进行数据分析。计数资料采用例数表示，组间比较采用Fisher确切概率法。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

自体血及纳米碳组定位后当场死亡各1只，考虑麻药过量引起，按随机分配原则分别各添加1只补充后存活。

2.1 自体血组与纳米碳组术后肉眼观(术后第1、3、5、7天) 自体血组定位术后第1和3天可见结肠系膜血肿，自体血定位术后第5和7天结肠肠壁及系膜均未见明显血肿。纳米碳定位术后第1、3、5、7天结肠肠壁及系膜均可见黑色标记，即残留纳米碳，见图1。

A～D.自体血组术后第1、3、5、7天；E～H.纳米碳组术后第1、3、5、7天。

2.2 自体血组与纳米碳组术后病理观(术后第1、3、5、7天) 成片及散在红色物为血液组织(即血肿)，为阳性；另可见脂肪组织(白色空泡样物)及炎症细胞(散在黑色点状物)，见图2A～B。不规则小斑块及点状黑色物为纳米碳，为阳性；脂肪组织(白色空泡样物)、炎症细胞(散在紫色点状物)见图2C；血管(不规则含肌层空腔)、肠壁平滑肌见图2D。

A、B.自体血组病理切片；C、D.纳米碳组病理切片。

2.3 自体血组与纳米碳组肉眼观及病理观术后定位效果比较 因生理盐水组为空白对照组，肉眼观及病理观结果均为阴性，故不纳入比较。自体血组与纳米碳组定位后肉眼观第1、3天阳性率对比差异无统计学意义(P>0.05)，而术后第5、7天阳性率对比差异有统计学意义(P<0.05)。自体血组与纳米碳组定位后病理观第1、3天阳性率对比差异无统计学意义(P>0.05)，而术后第5、7天阳性率对比差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、2。

表1 自体血组与纳米碳组肉眼观定位效果比较

表2 自体血组与纳米碳组病理观定位效果比较

3 讨论

大多数结肠肿瘤患者结合术前肠镜、气钡灌肠造影、增强CT等检查可对肿瘤位置有初步判断。临床上如肿瘤侵犯外膜，有经验的术者术中可通过腔镜间接感受质中或质硬瘤体，从而协助明确肿瘤位置。如肿瘤位于回盲部，则可行右半结肠切除术，即使没有定位亦可达到根治目的[4]。如肿瘤位于直肠以上，尤其是乙状结肠，脾、肝区等部位，且肿瘤较小、位于肠系膜侧、浆膜面无累及或有局部粘连者，术中肉眼无法观察或腔镜无法探及，将会导致精确定位困难[5]。此外，内镜治疗后需要补充手术者，存在多原发病灶者以及肿瘤复发者，由于解剖位置改变，肠粘连等原因可导致术中定位困难，通常需要术前精确定位。

我们目前通常进行术前金属夹标记联合卧位腹平片定位，或行术前内镜注射染色剂定位。由于有些患者肠管壁肠脂垂肥厚，腹腔镜手术又缺乏触觉反馈，往往术中不能精确找到金属夹位置，且金属夹还存在术前脱落风险。Conaghan等认为只要术者预计术中结直肠肿瘤定位难以明确，就有必要术前行内镜下染色剂注射定位[4]。靛胭脂、美兰等肿瘤局部黏膜下注射花费少，操作简单,但存在易消散、褪色的缺点,手术时机应尽量控制在染色后2 h内[6-8]；但肠镜定位后马上手术，肠道内的积气会使肠管扩张，影响术中的暴露和解剖。纳米碳作为一种新型染色剂，近年来常被用于术中不宜触及的小病灶或未侵及浆膜层不易视及的病灶提供定位[9-10],并有利于术后标本淋巴结分拣数量的提高，为术后病理分期提供更准确的依据[11]。其在组织中染色保留的时间可持续数月之久，术前肠镜下黏膜下多点注射纳米碳行术前定位是有效的[10，12]。但是将最适量的纳米碳注射到黏膜下层是困难的，过多的纳米碳或过深的注射会使整个腹膜染色，使息肉切除部位的位置变得模糊[13]，影响操作层面解剖。在本研究中，我们观察到自体血外溢不会污染组织，擦拭后仍可保持视野清晰。

从经济学角度考虑，自体血取材方便，定位成本可忽略不计。而纳米碳价格昂贵，暂时未进入医保，临床广泛使用会增加患者经济负担。此外自体血的使用不存在伦理学问题，也不会对机体造成伤害。而纳米碳属于纳米材料，其对人类身体器官和生殖发育的影响还不明确，有报道显示当纳米碳材料进入血液循环后，可以迅速地与内皮组织发生反应，促进血栓的形成。纳米碳在多次给药的情况下，碳点可诱发氧化应激损伤，破坏机体的免疫平衡，最终导致机体相关免疫器官发生可代偿的病理病变[14]。

目前临床上自体血定位尚未普及，有研究显示临床工作中行自体血定位后95.0%的患者定位效果达到预期，且均未出现明显并发症[3]。这与Lee等[15]报道的92.0%的有效率类似，证明了该方法是安全有效的。

本研究结果显示，自体血与纳米碳于大鼠结肠肠壁定位后第1～3天效果一致，5 d后纳米碳定位效果优于自体血。有报道显示大鼠的生物代谢率是人的30倍，组织修复能力强，提示我们可以在手术前3 d内进行自体血定位。该方法安全、简便、廉价，临床上有良好的推广和使用价值。但本研究未设置更精确的时间组对比纳米碳及自体血定位效果，可后期进一步研究；未行自体血及纳米碳组大鼠炎症指标的对比，两者炎症反应比较也尚不明确；故纳米碳及自体血定位的临床运用尚需大样本多中心的研究支持。