DABS-Cl柱前衍生HPLC测定发芽糙米粉中γ-氨基丁酸

杜金凤，郭航宏，陶晓杰，张念洁，宋鉴达

延边朝鲜族自治州产品质量检验所（延吉 133000）

糙米是稻谷脱壳后不加工或者较少加工所获得的全谷米粒，富含丰富的膳食纤维、维生素和矿物质，由米糠、胚、和胚乳三大部分组成，是一种功能性食品[1]。糙米在一定的工艺条件下萌发生芽，经加工干燥后会得到具有活性的发芽糙米，糙米在发芽过程中会激活并释放蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等生物活性成分，能催化蛋白质、淀粉、纤维素等功能物质的富集和转化。经研究发现，稻谷发芽会激活稻米中的谷氨酸脱氢酶，谷氨酸脱羧酶水解产生的蛋白质形成的谷氨酸中含有大量的γ-氨基丁酸[2-3]。

γ-氨基丁酸（GABA）是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，广泛存在于动物、植物、真菌等各种生物体内。现代医学研究表明，γ-氨基丁酸（GABA）具有降三压、缓解心率[4-6]、镇静神经、预防老年痴呆、抗肿瘤、排毒、增强免疫力等功效[7-9]，具有很高的保健价值和医用价值。

目前，国内外关于发芽糙米粉中γ-氨基丁酸含量的测定方法主要有比色法[10]、高效液相色谱法、毛细管电泳法、氨基酸分析仪法[11-13]等。其中比色法、薄层色谱法操作简单，成本较低，但发芽糙米粉样品成分复杂，含有多种游离氨基酸，能与显色剂发生化学反应，比色时容易产生干扰，影响测定结果，毛细管电泳法实验操作过程复杂、氨基酸自动分析法的分析仪器价格比较昂贵，限制其使用。高效液相色谱仪具有测定结果准确、检测效率高等优点而被广泛应用。由于γ-氨基丁酸本身对紫外光吸收小，一般需要衍生化后才能被用紫外或荧光检测器检测。国内外常采用的衍生试剂有2, 4-二硝基氟苯（FDNB）、邻苯二甲醛（OPA）-巯基乙醇、异硫氰酸苯酯（PITC）等[14-17]，但存在反应条件苛刻、样品前处理复杂、衍生产物不稳定、试剂毒性大等缺点[18-19]。试验采用4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl）[20]为衍生试剂柱前衍生，通过HPLC测定发芽糙米粉中的γ-氨基丁酸含量，旨在建立准确高效的发芽糙米粉中γ-氨基丁酸定量分析方法，为发芽糙米粉中的γ-氨基丁酸的含量分析和质控提供理论技术支持。

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）标准品（纯度99.9%，国家标准物质中心）；无水乙醇（优级纯（色谱纯，国药化学集团有限公司）；4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl，美国AAT Bioquest公司）。试验用水（色谱纯，德国CNW Technologies公司）。发芽糙米粉样品（本单位送检样品）。

Aglient-1260型高效液相色谱仪、二极管阵列检测器；C18反相柱；TD6M低速离心机（盐城市凯特实验仪器有限公司）；精密天平（奥豪斯仪器有限公司）；QL-901旋涡振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；KQ-600DV超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）；FZl02微型植物试样粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。

1.2 溶液的配制

4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl）衍生溶液：称取20.0 mg 4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯粉末，用乙腈溶解并稀释至10 mL，过0.22 μm有机滤膜，现用现配。

碳酸氢钠溶液：称取0.40 g碳酸氢钠，用水溶解并稀释至10 mL，过0.22 μm水相滤膜，现用现配。

50 mmol/L三水合乙酸钠溶液：称取6.80 g三水合乙酸钠，用水溶解并稀释至1 L，过0.22 μm水相滤膜，备用。

γ-氨基丁酸标准储备溶液：精确称取0.01 g（精确至0.000 1 g）γ-氨基丁酸（GABA）标准品，用乙腈稀释并定容至10 mL，得到质量浓度为1.0 mg/mL的标准溶液a，于-18 ℃贮存在棕色瓶中保存，备用。

γ-氨基丁酸标准工作溶液：取a液，用乙腈逐级稀释成质量浓度为20，40，60，80和100 μg/mL的标准工作溶液，待测，现用现配。

1.3 样品前处理

将发芽糙米样品混匀，缩分至约50 g，用粉碎机充分粉碎后全部过0.250 mm直径筛，均质，装入密闭容器中，室温保存，备用。

1.3.1γ-氨基丁酸提取

准确称取1 g（精确至0.000 1 g）样品于50 mL离心管中，加入10 mL 80%的乙醇溶液，旋涡振荡2 min，在50 ℃下超声提取30 min，静置5 min后，于4 000 r/min离心5 min，上清液转移至25 mL容量瓶中，样品残渣再用10 mL 80%乙醇溶液按上述步骤提取一次，合并两次上清液，最后用80%乙醇溶液定容，摇匀，用0.22 μm有机滤膜过滤，待衍生化。

1.3.2 衍生化试验

准确吸取1 mL试样溶液、1 mL标准工作溶液、1 mL 80%乙醇溶液于10 mL具塞试管中，分别加入0.2 mL碳酸氢钠溶液和0.4 mL 4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl）溶液，旋涡混匀，在70 ℃水浴中衍生反应20 min，冷却至室温，用0.22 μm有机滤膜过滤，待测。

1.4 液相色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：三水合乙酸钠溶液-乙腈=65∶35（V/V）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 μL；紫外检测器：检测波长438 nm。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的确定

采用二极管阵列检测器（DAD）对γ-氨基丁酸标准品衍生产物在210～600 nm范围内进行波长全扫描，所得吸收光谱如图1所示。衍生产物在438 nm处有最大吸收峰，且此处干扰峰较少，故选择438 nm为作为γ-氨基丁酸的检测波长。

图1 γ-氨基丁酸的全波长扫描吸收光谱

2.2 色谱条件的优化

液相色谱法测定γ-氨基丁酸常用磷酸盐缓冲溶液-甲醇或者乙酸钠溶液-乙腈为流动相，研究表明，磷酸盐缓冲溶液-甲醇为流动相时，需要梯度洗脱，洗脱时间较长，且基线不稳，采用乙酸钠溶液-乙腈为流动相时，洗脱时间缩短，且基线稳定，分离度高。试验选用Aglient-C18反相色谱柱对γ-氨基丁酸进行分离，以50 mmol/L三水合乙酸钠溶液-乙腈（65∶35，V/V）为流动相，流速1.0 mL/min，所得的γ-氨基丁酸标准品、发芽糙米粉样品、衍生化试剂DABS-Cl的液相色谱图如图2所示。发芽糙米粉中γ-氨基丁酸的保留时间为4.637 min，与γ-氨基丁酸标准品的保留时间4.641 min基本保持一致，衍生试剂DABS-Cl的保留时间为3.255 min，基线稳定，对被测物质色谱峰无干扰，分离度高无拖尾，峰型左右对称，样品分离时间短，表明该条件下γ-氨基丁酸的分离效果较好。

图2 不同样品的色谱图

2.3 柱前衍生化条件的优化

2.3.1 衍生时间的影响

设定衍生化反应温度70 ℃，考察不同衍生时间对标准品衍生物峰面积的影响。取1 mL 40 μg/mL的γ-氨基丁酸标准工作溶液，准确加入0.2 mL碳酸氢钠溶液和0.4 mL 4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl）溶液，旋涡混匀，在70 ℃水浴中分别反应5，15，20，25，30，35和40 min，冷却至室温，用0.22 μm有机滤膜过滤，每种条件平行试验3次，根据色谱条件测定，衍生时间对γ-氨基丁酸标准品峰面积的影响结果见图3。当衍生反应时间为20 min时，进样后检测的峰面积最大，随着反应时间的不断延长，衍生化产物稳定性降低，峰面积减小，故选择20 min为衍生反应的时间。

图3 衍生时间对γ-氨基丁酸标准品峰面积的影响

2.3.2 衍生温度的影响

设定衍生化反应时间20 min，考察不同衍生温度对标准品衍生物峰面积的影响。按2.3.1小节，取1 mL 40 μg/mL的γ-氨基丁酸标准工作溶液，准确加入0.2 mL碳酸氢钠溶液和0.4 mL 4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl）溶液，旋涡混匀，分别在60，65，70，75，80和85 ℃水浴中衍生反应20 min，冷却至室温，用0.22 μm有机滤膜过滤，每种条件平行试验3次，根据色谱条件测定，衍生温度对γ-氨基丁酸标准品峰面积的影响结果见图4。当衍生温度为70 ℃时，标准品衍生物峰面积最大，且峰面积趋于稳定，随着反应温度升高到80 ℃，衍生化产物稳定性降低，峰面积急剧减小，故选择70 ℃作为衍生温度。

图4 衍生温度对γ-氨基丁酸标准品峰面积的影响

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系考察及检出限

将1.2.5小节所配制的γ-氨基丁酸标准工作溶液按1.3.2小节的衍生化试验条件反应，根据色谱条件测定，以γ-氨基丁酸质量浓度为横坐标，衍生后产物响应值为纵坐标，绘制标准曲线，如图5所示。γ-氨基丁酸在20～100 μg/mL质量浓度范围内呈现良好的线性关系，线性回归方程Y=4.318 8X+9.956 2，R2为0.999 6。以3倍的信噪比（S/N=3）计算方法的最低检出限（LOD），结果为0.1 mg/kg；以10倍的信噪比（S/N=10）计算方法的定量限（LOQ），结果为0.4 mg/kg。结果表明，该方法灵敏度高，能满足发芽糙米粉中γ-氨基丁酸的日常检测、定量和质量控制要求。

图5 γ-氨基丁酸标准曲线

2.4.2 精密度试验、重复性试验和稳定性试验

精密吸取10 μL衍生后的20 μg/mLγ-氨基丁酸标准溶液，平行进样6次，记录峰面积，计算相对标准偏差。连续测定6次的标准品峰面积分别为91.14，92.00，91.93，91.64，90.11和91.93，相对标准偏差（δRSD）为0.80%，表明该方法仪器精密度良好，准确度高。

取发芽糙米粉样品，按照样品前处理方法同时制备6份平行样品溶液测定，以样品中γ-氨基丁酸峰面积考察试验重复性。结果显示，相对标准偏差（δRSD）为0.36%，表明该方法具有良好的重现性。

精密吸取10 μL衍生后的20 μg/mLγ-氨基丁酸标准溶液，分别于0，2，4，6，8，10和24 h进样，测定γ-氨基丁酸峰面积。结果显示，γ-氨基丁酸峰面积的相对标准偏差（δRSD）为1.08%，表明该方法在24 h内稳定，具有良好的稳定性。

2.4.3 加标回收率试验

按试验方法对空白基质精白米进行加标回收试验，每个浓度平行试验6次，按1.3小节的样品前处理方法制备样品溶液，并根据色谱条件测定，外标法定量，计算样品的加标回收率，结果见表1。结果显示，在3个加标水平下，γ-氨基丁酸的回收率为95.80%，97.39%和97.14%，平均回收率为96.78%，回收率良好，表明该方法下测得的样品γ-氨基丁酸含量准确可靠。

表1 加标回收率试验结果（n=6）

2.5 实际样品的检测

采用该方法对单位送检的5批次发芽糙米粉样品进行测定。每个样品平行取2份，取平均值作为测定结果。所检测的5批次发芽糙米粉的γ-氨基丁酸含量分别163.25，158.74，59.23，62.78和209.85 mg/kg。

3 结论

试验建立了DABS-Cl柱前衍生HPLC测定发芽糙米粉中活性成分γ-氨基丁酸含量的分析方法，采用超声提取，DABS-Cl柱前衍生化，生成的衍生产物在24 h内稳定，分离度高。该方法前处理简单、重现性好、分析时间短、无基质干扰、检测成本低，适用于发芽糙米粉中γ-氨基丁酸的测定。