QuEChERS-HPLC-MS/MS法同时测定豆芽中18种植物生长调节剂

王岩，王磊，郑百芹，王帅，赵海涛，李彤

1.唐山市食品药品综合检验检测中心（唐山 063000）；2.河北省农产品质量安全检测技术创新中心（唐山 063000）；3.唐山市功能性农产品产业技术研究院（唐山 063000）

植物生长调节剂（PGRs）是一类与植物激素具有相似生理和生物学效应的物质，也被称为植物天然激素或植物内源激素，可影响和有效调控植物的生长和发育，包括从细胞生长、分裂，到生根、发芽、开花、结实、成熟和脱落等一系列植物生命全过程。近年来，滥用及不当使用PGRs的现象时有发生，影响农产品的食用安全，对人民健康造成威胁[1-4]。原国家食品药品监督管理总局、原农业部及原国家卫生和计划生育委员会发布的2015年11号公告中明令禁止在豆芽中使用6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸和赤霉素等生长调节剂类物质。因此，开展豆芽中植物生长调节剂残留的快速检测新技术研究，对保证食品安全、促进国民健康及社会经济发展都有重要的现实意义。

中国关于植物生长调节剂的多残留检测技术和有关限量标准的基础研究处于起步阶段，多残留同时检测的国家标准尚未建立。有关植物生长调节剂残留的检测方法主要有酶联免疫（ELISA）法[5]、气相色谱（GC）法[6]、气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）法[7]、高效液相色谱（HPLC）法[8]、液相色谱-质谱（LC-MS）法和高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法[9]。GC和GC-MS/MS需要进行化学衍生，操作较为繁琐。ELISA灵敏度较低，难以实现痕量分析。HPLC的灵敏度较低，基质干扰影响较大，前处理复杂并且容易造成假阳性干扰。HPLC-MS/MS具有灵敏度高、选择性好等优点，在满足复杂基质痕量残留分析的基础上，实现多残留化合物的同时分析，是PGRs残留分析的优选方法。试验采用QuEChERS方法结合HPLC-MS/MS测定豆芽中18种PGRs的残留量，旨在为标准的修订及有效监控豆芽中的PGRs残留提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 6460型HPLC-MS/MS（安捷伦科技（中国）有限公司）；099ADPM12型涡旋混匀仪（上海易扩仪器有限公司）；3-15型高速离心机（德国Hettich公司）；EVA50A型氮吹仪（美国Organomation Associates公司）；T-200电子天平（常熟双杰仪器制造厂）；SZ13022-NY 0.22 μm有机滤膜（天津市领航实验设备股份有限公司）。

18种PGRs标准品：氯吡脲、赤霉酸、环丙酸酰胺、脱落酸、吲哚丙酸、吲哚乙酸、对氯苯氧乙酸、噻苯隆、6-苄氨基嘌呤、4-碘苯氧基乙酸、抑芽唑、2, 4-D、萘乙酸、烯效唑、抗倒胺、多效唑、吲哚丁酸、抗倒酯（纯度≥99.0%，国家标准物质中心）；C18、石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）（上海安谱公司）；甲醇、甲酸、乙腈、NH4AC（色谱纯，美国ASC公司）；无水硫酸镁、氯化钠、乙酸（分析纯，上海国药化学试剂有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱Phenomenex H18（50 mm×3.00 mm，2.60 μm）；进样体积5 μL；柱温35 ℃。流动相：A为含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液，B为甲醇。梯度洗脱：0.5～5.0 min，10% B；5.0～8.0 min，95% B；8.0～12 min，10% B；流速0.25 mL/min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正（ESI+）、负（ESI-）离子扫描方式；雾化气流量3.00 L/min；干燥气流量15.00 L/min；DL管温度250 ℃；电喷雾电压（IS）2 500 V；扫描时间0.1 s；多反应监测模式（MRM）。

1.2.3 标准溶液配制

分别准确吸取100 μL质量浓度1 000 μg/mL的单个PGR标准物质，用甲醇定容至10 mL，得到质量浓度10 μg/mL的混合标准储备液，于4 ℃冰箱内保存。取样品空白溶液分别配制0.005，0.01，0.020，0.040和0.050 μg/mL的基质混合标准工作液，现用现配。

1.2.4 样品前处理

称取5.0 g豆芽样品于离心管外管中，加入混合标准溶液（外标法），静置30 min，加入10 mL 5%乙酸-乙腈（1∶99，V/V），加入萃取盐包（内含5.5 g无水硫酸镁、1.5 g氯化钠、0.5 g柠檬酸氢二钠和1.0 g柠檬酸钠）及10颗锆珠，拧紧内管（内含4 mm氧化锆珠5粒、200 mg PSA、500 mg无水硫酸镁和100 mg C18）后放入自动QuEChERS前处理仪器中开始处理，经25 min交替振荡离心后，准确吸取1.0 mL上清液氮吹近干，用10%甲醇溶液定容，经0.22 μm的有机微孔滤膜，滤液供HPLC-MS/MS测定。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

分别取1 000 μg/L的18种PGRs标准溶液通过针泵注入质谱系统进行参数优化。在正、负离子模式下进行全扫描，扫描范围m/z50～500，得到18种PGRs的一级质谱图。由于18种PGRs的性质不同，其电离方式也有所差异，因此确定其合适的电离方式，以达到最高的电离效果。选择响应最高的离子作为准分子离子，优化去簇电压（DP），以获得最强的母离子信号，并选择响应较强的2个离子作为定量离子和定性离子，在多反应监测（MRM）模式下，优化碰撞能（CE）。质谱参数如表1所示。

表1 18种植物生长调节剂的质谱参数

2.2 色谱条件的优化

比较Phenomenex H18色谱柱（50 mm×3.00 mm，2.60 μm）、Zorbax SB-C18色谱柱（100 mm×2.1 m，3.5 μm）和Waters Acquity BEH C18（50 mm×2.1 mm，7.0 μm）对待测物的分离效果，结果表明，18种PGRs在Phenomenex H18色谱柱上的分离效果和峰形最好。因此，试验选择Phenomenex H18色谱柱分析待测物。

试验比较乙腈-水和甲醇-水作为流动相的分离效果，考察其对18种PGRs的洗脱效果，结果表明，使用甲醇-水作为流动相时，18种待测物在色谱柱上的保留时间最短，分离效果和峰形更好，因为甲醇作为有机相时，待测物具有更高的响应值和灵敏度。试验表明，流动相中加入甲酸会使待测物的离子化，而乙酸铵对负离子模式下目标物的离子化效果具有促进作用。分别配制浓度为：1）0.1%甲酸-1 mmol/L乙酸铵-甲醇；2）0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵-甲醇；3）0.1%甲酸-10 mmol/L乙酸铵-甲醇；4）0.3%甲酸-5 mmol/L乙酸铵-甲醇的流动相，试验结果表明0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵-甲醇作为流动相时，各目标物的响应和峰形均为最优。在最优洗脱条件下，18种PGEs的保留时间在5.8～11.7 min。

2.3 净化条件的优化

分散固相萃取技术（QuEChERS，即quick，easy，cheap，effective，rugged and safe），是近年来国际上最新发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术，其主要通过极性相互作用、非极性相互作用、离子相互作用等方式保留基质干扰成分，达到净化效果。主要的吸附材料有石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）和C18，其中PSA主要对极性物质有较强的吸附作用，去除有机酸、色素、金属离子和酚类等物质；GCB可有效去除色素；C18对非极性物质有很强的吸附作用。试验选择50 μg/L的混标质量浓度，考察（1）100 mg C18+25 mg GCB+500 mg MgSO4；（2）100 mg C18+200 mg PSA+500 mg MgSO4；（3）25 mg GCB+200 mg PSA+500 mg MgSO4；（4）100 mg C18+200 mg PSA+25 mg GCB+500 mg MgSO44种条件下的净化效果和加标回收率，结果见图1。其中，采用100 mg C18+200 mg PSA+500 mg MgSO4为净化剂时，18种PGRs的回收率在80%～115%，因此，采用100 mg C18+200 mg PSA+500 mg MgSO4作为样品净化的吸附剂。

图1 18种植物生长调节剂在不同净化组合中的回收率（n=3）

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围、检出限和定量限

基质效应是一个常见干扰因子，指样品共提取的基质会影响目标物的离子化，产生的共提取物存在基质增强或抑制效应，采取适当的方法减少或消除，可以提高测定准确度和精密度。试验以不含目标物的豆芽样品作为空白基质，采用空白基质溶液配制标准溶液，以消除基质效应的影响。取质量浓度分别为0.005，0.010，0.020，0.040和0.050 μg/mL系列基质标准溶液，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，线性回归方程和相关系数见表2。结果表明，18种PGRs在质量浓度范围0.005～0.05 μg/mL时具有良好线性关系，相关系数（r）均≥0.999 0。以3倍信噪比（S/N=3）计算方法检出限（LOD），以10倍信噪比（S/N=10）计算方法定量限（LOQ），结果显示，18种PGRs的LOD为0.3～1.2 μg/kg，LOQ为1.0～5.0 μg/kg（表2）。

表2 18种PGRs的线性关系、相关系数、检出限和定量限

2.4.2 方法的回收率和精密度

以不含目标组分的5.0 g豆芽样品作为空白基质，添加18种PGRs标准品，分别配制添加质量浓度水平为10，100和200 μg/kg的样品各3份，每个质量浓度水平重复测定6次，计算测定值的相对标准偏差（δRSD）。由表3可知，各添加质量浓度水平的平均回收率为85%～110%，δRSD为2.8%～7.5%，方法的准确度和精密度均满足残留分析的要求。

表3 18种PGRs添加回收率和精密度（n=6）

2.5 实际样品分析

应用所建立的分析方法对市场上随机购买的30批次豆芽样品进行检测，在受检样品中，其中有3个批次样品检出4-氯苯氧乙酸（4-CPA），其含量低于定量限；2个批次样品检出6-苄基腺嘌呤（6-BA），质量分数分别为2.4和10.6 μg/kg，为不合格样品。其他16种PGRs均未检出。

3 结论

试验采用5%乙酸-乙腈（1∶99，V/V）作为提取溶剂，利用QuEChERS法对样品进行净化处理，通过优化色谱和质谱条件，建立豆芽中18种PGRs的HPLCMS/MS同时测定方法。该方法操作简单、灵敏度高、重现性好，精确度和准确度均满足方法学指标，可用于同时测定豆芽中18种PGRs残留量。