双酵母混合液态发酵生产杨梅果酒

李晓娟

株洲千金药业股份有限公司（株洲 412000）

杨梅（Myrica rubra（Lour.）Sieb.et Zucc.）是我国传统特色水果，野生杨梅已有7 000年的历史，种植也有2 000年的历史[1]。中医认为，杨梅味甘酸，具有生津止渴和健胃消食等功效[2]，是酿造果酒的优良原料。周艳华等[3]采用杨梅和火龙果皮酿造高花色苷的保健杨梅果酒；Chang等[4]采用糯米水解糖液和红曲等固态发酵酿制富含氨基酸、矿质元素和香气的杨梅果酒。酯影响果酒品质，酿造时不仅要保证酒精度而且要提高酯的生成，助于酒香[4-5]，而发酵温度和酒精度影响酯生成[6]。杂醇油是酒精发酵过程中的副产物，不利果酒质量[7-8]。郝瑞颖等[9]研究了葡萄酒酿制的香气，其杂醇油高于300 mg/L降低葡萄酒质量。酵母菌包括酿酒和非酿酒酵母[10]，酿酒酵母活性高，生成酒体中的酒精度[11]，非酿酒酵母促进酒体的风味物质形成[12]，包括毕赤酵母[13]、假丝酵母[14]和梅奇酵母[15]等。两种酵母混酿可提升果酒品质和丰富风味口感[16]。安琪干酵母在较低营养能发酵，耐受性强、酒香丰富。产朊假丝酵母被美国食品药品监督局认定为一种安全和可作为食品添加剂[17]，我国原卫生部也将其允许用于保健食品。Chavan等[18]研究天然酵母和非酿酒酵母菌群在葡萄酒发酵过程中的影响，以便提高葡萄酒质量。

液态发酵法酿造果酒发酵速度快、易于控制[19]。因此，此次试验研究双酵母混合液态酿造杨梅果酒综合技术，在实现快速发酵，满足酒精度和酯香好的双重目标，并使杂醇油得到合理控制，为快速生产品质优良的杨梅果酒提供理论和方法依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

东槐杨梅，产于福建省长汀县；安琪葡萄酒干酵母 BV818、RV171，Angel酵母股份有限公司；产朊假丝酵母CU-6，中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）；大豆多肽，菏泽中食肽好生物制品厂；酵母提取粉（BR），广东凯微生物科技有限公司；胰蛋白胨（BR）、琼脂粉（BR）、偏重亚硫酸钾（AR）、碳酸氢钠（AR），国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖（AR），上海实验试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器与设备

LZ-0.5型小型螺旋榨汁机，江苏科威机械有限公司；TDL-5-A型低速离心机，上海安亭科学仪器厂；DHG-9000型恒温干燥箱，上海精宏试验设备有限公司；UV-1100型分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；TC8400001型自动测氮仪，FOSS；RE-2200A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；Sartorius普及型pH计，合肥桥斯仪器设备有限公司；YXQ-LS-18SII型全自动立式电热压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；NSKY-200B型恒温培养振荡器，上海苏坤实业有限公司；YXQ-LS-18SII型全自动立式电热蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司；Blue Pard型隔水式培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；YXQ-LS-18SII型全自动立式电热压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；A199型GC，Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 测定指标及分析方法

还原糖：直接滴定法，按GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》执行；总糖：直接滴定法[20]；总氮：凯氏定氮法[21]；氨基酸态氮：双指示剂甲醛滴定法；pH：pH计法[22]；可滴定酸：电位滴定法[23]；可溶性固形物：折光仪法；总果胶：重量法[24]；酵母数：按GB/T 4789.15—2010《食品微生物检验霉菌和酵母计数》执行；酒精度：按GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》酒精计法执行；甲醇和杂醇油：气相色谱法，按GB/T 5009.48—2003《蒸馏酒与配制酒卫生标准的分析方法》执行。

1.2.3 数据分析方法

应用Design Expert（Version 8.0.6）软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 杨梅果汁的理化指标

从表1可看出，杨梅汁的含糖质量分数适中，酸度较高，总氮质量分数低，需适度降酸、提高糖度和添加氮源以满足酵母生长和风味成分。

表1 杨梅果汁的理化指标

2.2 酵母的选择

2.2.1 酵母菌种的确定

接种量为0.4%，初始还原糖为24 g/100 g，发酵温度为24 ℃。由图1、图2和表2可知，安琪酵母发酵时还原糖2 d内快速下降；CU-6发酵4 d内还原糖缓慢降低，发酵周期较长。两种安琪发酵前期酵母数增长快而CU-6较慢，到第3天后生长明显加快，安琪BV818、RV171发酵时酒体酒精度相对比较高、残糖量较低，BV818发酵的酒精度达12.6%vol，总酯为1.47 mg/L。CU-6发酵时总酯最高，达到1.76 mg/L，口感较协调，因产朊假丝酵母能改善果酒风味，使果香浓郁[27-28]，所以选择发酵速率最快的BV818和产酯能力最强的CU-6混合发酵，以达到产酒和产酯能力好的双目标。

表2 三种酵母的酒精发酵效果对比

图1 不同酵母对杨梅果酒还原糖的影响

图2 不同酵母对杨梅果酒酵母数的变化

2.2.2 酵母比例的确定

初始还原糖为24 g/100 g，发酵温度为24 ℃，接种量为0.4%。由图3和图4可看出，采用BV818和CU-6体积比1∶1，1∶1.5和1∶2发酵时还原糖下降相对缓慢，酵母生长较慢；1.5∶1和2∶1时，还原糖下降较快，酵母生长也较好。体积比为1∶1发酵时速度慢。经检测，发酵至7 d时，残糖量为1.54 g/100 g，总酯质量浓度为2.81 mg/L，经品尝酒质柔爽，果香、酒香浓郁。因此，BV818和CU-6的体积比以1∶1为宜。

图3 酵母体积比对杨梅果酒还原糖的影响

图4 酵母体积比对杨梅果酒酵母数的影响

2.2.3 多肽添加量的确定

混合酵母接种量为0.4%，初始还原糖为24 g/100 g，于24 ℃进行发酵。从图5和图6可看出，多肽0～2 g/L时，还原糖下降和酵母数增加缓慢，说明氮源不足以维持酵母生长，酒质混浊。多肽4～6 g/L时，还原糖下降和酵母数增加相对较快，酒质较柔爽，说明多肽能满足发酵过程中所需氮源；多肽4 g/L，发酵至7 d时酒精度为8.9%vol，总酯质量浓度为2.68 mg/L，发酵情况最好，酒香、果香浓郁；高于8 g/L时，还原糖下降较快，酵母生长过剩，酵母衰老。因此，多肽选择4 g/L左右为宜。

图5 多肽添加量对杨梅果酒还原糖的影响

图6 多肽添加量对杨梅果酒酵母数的影响

2.3 酒精发酵的单因素试验与分析

调整杨梅汁初始还原糖24 g/100 g、多肽4 g/L、双酵母体积比1∶1，从图7可看出，酵母0.4%发酵至第7天时，酒精度为13.1%vol，总酯为2.68 mg/L，均最高，酒质柔爽；酵母过高酒精度反而降低，使杨梅果酒酒香不足，说明发酵过于旺盛。18～22 ℃时，发酵缓慢，酒精度不高；24 ℃时，酒精度增长最快；28 ℃第3天后，酒精度随之降低，因温度过高，酵母衰老快。pH 3.8发酵速度较快，至第7天时酒精度为12.9%vol，之后发酵速度稍下降。当SO2低于20 mg/L时，随SO2的增加，发酵速度加快，酒精度增加；SO2为40 mg/L时发酵状况最好，SO2再增加反而酒精度降低。单因素试验结果表明，杨梅果酒酒精发酵以酵母接种量0.4%，温度24 ℃，SO240 mg/L，pH 3.8为宜。

图7 单因素对杨梅果酒酒精度的影响

2.4 响应面分析法优化酒精发酵工艺条件

在酒精发酵的单因素试验与分析的基础上，选取对酒精发酵过程影响较大的接种量（X1，BV818和产朊CU-6的体积比为1∶1）、温度（X2）、SO2添加量（X3）三个因子作为考察因素，选择酒精度和总酯含量作为响应值，优化酒精发酵工艺。试验条件为初始还原糖24 g/100 g、多肽添加量4 g/L、初始pH 3.8，发酵时间7 d。因素水平见表3，试验结果见表4。

表3 杨梅果酒因素水平表

表4 杨梅果酒试验设计方案及结果

采用Design Expert（Version 8.0.6）对表3中的数据进行回归分析，计算出回归方程各系数，得到各个因素与杨梅果酒的酒精度Y1和总酯Y2多元二次回归方程式：

由表5可知，杨梅果酒中酒精度和总酯检验极显著（p＜0.01），失拟项不显著（p＞0.05），说明数据的相关度高，拟合性好。

表5 回归检验方差分析

接种量对杨梅果酒酒精度和总酯影响极显著（p＜0.01），温度影响为显著（p＜0.05），SO2添加量的影响不显著。影响因素主次顺序为接种量＞温度＞SO2添加量。二次项的接种量、温度、SO2添加量均极显著（p＜0.01）。接种量与温度的交互作用极显著（p＜0.01），接种量与SO2添加量的交互作用显著。

综上所述，响应面分析法优化杨梅果酒酒精发酵的最优工艺参数为接种量0.3%、温度24 ℃、SO2添加量55 mg/L、初始还原糖24 g/100 g、pH 3.8、多肽添加量4 g/L、发酵时间7 d。在此条件下，杨梅果酒的酒精度为12.7%vol，总酯含量为3.22 mg/L。

2.5 陈酿前后杨梅果酒中的甲醇及杂醇油对比

甲醇由果胶水解、甘氨酸脱羧反应生成，有较强的毒性，经消化道迅速吸收代谢产生甲酸和甲醛，损伤视觉和脑神经细胞，严重可致失明[29]。杂醇油由发酵中氨基酸和蛋白质降解代谢产生，以戊醇、丙醇、丁醇、苯乙醇、苯甲醇为主[30]。若杂醇油质量浓度过高，则出现苦涩味，可引起头痛等症状。目前我国相关标准尚未对果酒中的甲醇及杂醇油限定。葡萄酒中杂醇油质量浓度一般在250～350 mg/L之间[31]。因此，可以此为参照对杨梅果酒进行判定。通常果酒的陈酿期为90～180 d。

从表6可以看出，陈酿前酒体中均未检出甲醇，杂醇油质量浓度为290.37 mg/L，总量处于标准要求的水平，说明酵母和酒精发酵工艺合理，发酵温度高是产生甲醇和杂醇偏高的主要原因[32]。陈酿前异戊醇质量浓度最高，为148.00 mg/L；异丁醇质量浓度亦较高，为45 mg/L。异戊醇、异丁醇是由发酵的中间产物丙酮酸或乙醛生成的。酵母将酒中多的氨基酸转化为高级醇，部分直接转化为酯类和有机酸，后期与高级醇反应生成酯[30]。因此，通过陈酿，酒体中的杂醇油的质量浓度进一步降低，并可提高酒的柔爽性。陈酿60 d时，杂醇油由陈酿前的290.38 mg/L降至168.22 mg/L，降低42.07%，异戊醇由148 mg/L降低至84.02 mg/L，减少43.23%；其他醇相应减小；陈酿至90 d时，杂醇油含量较陈酿至60 d时的相差很小，陈酿60 d和90 d的杨梅果酒酒质柔爽、酒香浓郁，口感相差不大，明显好于未陈酿的果酒。

3 结论

安琪酵母BV818的酒精发酵能力强，产朊假丝酵母CU-6的产酯能力好。当BV818和CU-6体积比为1∶1时，酒体的酒精度和总酯质量浓度均较高。杨梅汁中含氮量比较低，不足以提供酵母生长的需要。利用大豆多肽补氮源，多肽为4 g/L适宜。通过单因素试验和响应面分析法确定杨梅果酒的酒精发酵工艺，当初始还原糖24 g/100 g、初始pH 3.8、多肽4 g/L、接种量0.3%、温度24 ℃、SO255 mg/L时，发酵7 d后杨梅果酒的酒精度可达12.5%vol、总酯质量浓度为3.16 mg/L。采用气相色谱法对陈酿前后的杨梅果酒中甲醇和杂醇油进行测定分析，未检出甲醇；陈酿60 d后果酒中杂醇油质量浓度即可降至适当的水平，且口感、风味皆好。