综合设计性实验提升学生创新能力探索——以蛋黄卵磷脂的提取与鉴定为例*

王德信,杨晓莹

(1.菏泽学院农业与生物工程学院，山东 菏泽 274015；2菏泽学院学报编辑部，山东 菏泽 274015)

农学学科是应用型学科，专业实践性强，实验教学是重要的实践性环节，开设综合性设计实验是提高学生实践能力和创新能力重要方法[1].有效利用所学课程知识，掌握文献资料的查阅，系统的设计实验，准确分析实验结果，使学生认识实验因素的作用，获得与生产相关问题的分析技能，为农业生产工艺、农产品加工工艺优化设计等做出贡献.因此积极开设综合实验设计教学，对于提高学生统计分析能力以及实验设计水平具有重要意义[2].卵磷脂的提取纯化及鉴定实验是农学、食品科学等相关专业生物化学课程中的一个重要实验，重点要求学生掌握卵磷脂的提取工艺与鉴定方法，同时验证卵磷脂的基本性质.卵磷脂的提取与鉴定综合设计性实验要求学生通过正交试验设计方法优化蛋黄中卵磷脂的提取条件，训练学生实验设计水平并掌握分析方法，提升综合创新能力.

1 实验原理

卵磷脂又称磷脂酰胆碱、蛋黄素，在食品工业中广泛用作乳化剂、抗氧化剂、食品营养添加剂等[3].卵磷脂广泛存在于动植物中，是由脂肪酸、甘油、磷酸组成的甘油磷脂，大豆种子和蛋黄中含量较高，其中蛋黄中卵磷脂含量可达10%左右，含量最丰富，因此称为卵磷脂.卵磷脂具有抗衰老、增强记忆力、降血脂、修复脑损伤、降血糖、促消化、抗氧化以及提高免疫力等功效，因此卵磷脂被认为是排在蛋白质、维生素之后的“第三营养素”[4].

卵磷脂易溶于乙醚、苯、氯仿及乙醇中，不溶于丙酮；但丙酮能够溶解油脂和游离脂肪酸、甘油三酯等，因而可以利用乙醚、乙醇等有机溶剂进行提取[5].

蛋黄中卵磷脂提取与鉴定综合设计实验采用乙醇与乙醚的混合提取液为溶剂，利用丙酮沉淀卵磷脂，随后对沉淀物进行干燥，便可获得卵磷脂.卵磷脂中的胆碱在碱性溶液中可分解为三甲胺，具有特殊的鱼腥味，可根据此性质鉴定卵磷脂[6].

一般来说，卵磷脂是由胆碱磷脂(PC，phosphatidylcholine)、胆胺磷脂(PE,phosphatidylethanolamine)、肌醇磷脂(PI，phosphatidylinositol)等混合而成的混合物；狭义上的卵磷脂是指胆碱磷脂，分子式C35H66NO7P，分子量为643.875，分子结构见图1.

图1 卵磷脂分子结构(胆碱磷脂)

2 实验要求

该综合设计实验是《生物化学》课程的实验内容之一.具体要求：第一，掌握正交试验设计方法，学会制定实验设计方案；第二，掌握卵磷脂的提取工艺及实验操作；第三，学会应用统计学分析软件及方法分析实验结果.要求每一位同学认真查阅文献资料，制定详实的实验方案，认真做好每次实验的原始记录，以便进行资料整理和分析.

3 实验方法

3.1 试剂材料与设备

鸡蛋、乙醇、乙醚、氯仿、丙酮、氢氧化钠、植物油、纱布、滤纸、漏斗、烧杯、铁架台、玻璃棒、恒温水浴锅等，化学试剂均为分析纯.

3.2 实验方案

本实验中的温度、乙醇与乙醚混合物比例、抽提时间、物料比例等是影响卵磷脂提取率的重要因素，因此实验中涉及4个因素，采用多因素试验设计方法最合理，即正交试验设计.用特制的正交表格来安排实验，能够通过少量实验取得较好的效果.根据卵磷脂提取原理，将卵磷脂提取工艺流程设计为如图2所示，按照此流程，蛋黄提取液被逐步纯化，最终获得较纯的卵磷脂。根据要求用4因素3水平正交试验设计(表1).

图2 卵磷脂提取流程图

表1 抽提物、温度、时间和料液比

通过正交试验设计只需做9次实验，即可探索出最优条件，见表2.

表2 试验设计方案L9(34)

4 实验方法

4.1 卵磷脂的提取

选取新鲜鸡蛋1枚，轻轻在鸡蛋小头击破一个小孔，让蛋清从小孔中流出，取出蛋黄放置于烧杯中，搅碎备用.根据实验设计边搅拌边加入相应量的乙醇和乙醚混合提取液，控制相应温度，保温时间按照表2进行.提取结束后过滤，将滤液蒸干，加入氯仿抽提一次，抽提液用丙酮沉淀，卵磷脂即被沉淀出来，得到粗卵磷脂.

4.2 卵磷脂的纯化

取沉淀的粗卵磷脂，用少量无水乙醇溶解，得到乙醇粗提液，加入少量体积的20%的ZnCl2水溶液，充分搅拌；过滤，获得滤液，加入适量丙酮(4 ℃冰箱预冷)洗涤，充分搅拌，丙酮洗涤2次，洗涤液为无色状态，得到白色腊状物质，即为精卵磷脂.

4.3 卵磷脂鉴定

1)三甲胺实验，取制取的卵磷脂1份,放入试管中，加入10%NaOH溶液2 mL并在水浴上加热，卵磷脂分解生成胆碱，胆碱在碱的作用下，生成三甲胺，三甲胺有鱼腥昧.

2)乳化实验，取2支试管，分别加入10 mL蒸馏水，一支加入卵磷脂，并使之均匀分散在水中，加入10滴植物油；另一支不加卵磷脂作为对照，剧烈摇动后静置，比较试管内容物的乳化状.

5 实验结果

5.1 卵磷脂提取条件优化

卵磷脂提取率是指蛋黄中提取出的粗卵磷脂占蛋黄总质量的比例，利用正交试验设计，研究鸡蛋黄中卵磷脂的提取率，结果表明乙醇与乙醚5∶1的混合物，60 ℃浸提30 min，卵磷脂提取率高，可达45.1%，结果见表3.

表3 不同条件下蛋黄卵磷脂的提取率 %

5.2 卵磷脂的鉴定

通过三甲胺实验，说明卵磷脂在碱性环境中可水解为三甲胺，三甲胺有鱼香味，可证明提取物为卵磷脂.卵磷脂的乳化实验进一步证明卵磷脂的分子结构中具有亲水结构和疏水结构，可做乳化剂.

6 综合设计性实验的实验教学组织形式与效果

6.1 设计实验方法，创新研究内容的教学组织方式

由于本实验工作量大，内容涉及文献检索、实验设计、统计分析、生物化学等多个学科，要求组织学生分组，3～5人一组，查阅文献资料，学会利用正交试验设计方法，优化蛋黄中卵磷脂提取条件.

6.2 综合设计性实验的教学效果

通过以科学研究思维为导向，融合多门学科的综合设计性实验教学，将教学与科学研究有机结合，提高学生学习的兴趣，培养学生科研的思维能力，为今后的研究生学历教育奠定了基础.总体上看学生积极性高，能够自主完成实验设计及实验方案的制定任务，能够调动学生自主学习性，充分发挥学生的创新性思维，极大提升了学生对科学研究的兴趣.在实验成绩考核上，采用全过程考核方式，在规定的课时内完成整个实验，文献资源检索占比20%，实验设计及实验方案占50%，实验操作及实验结果占30%，实验考试贯穿整个实验流程，要求学生之间通力合作，培养学生的团队意识，实验过程中必须精心配合，分工合作.教师在整个实验过程中在实验设计及实验操作、结果分析等方面给予全程指导，及时更正，保证实验的顺利实施.

7 综合设计性实验教学的思考

综合设计性实验是有助于开发学生思维能力和创新能力的有效途径，积极开设综合设计性实验有助于培养学生科研思维，提升学科兴趣、巩固专业思想，同时为学好本专业相关课程奠定基础.但是综合设计性实验耗时长，涉及知识点多，需大量精力，另外实验设计相对复杂，有一定难度，同时需要教师精心设计并有足够耐心，才能取得相应效果，否则达不到预期目标.综合设计性实验是提升学生动手能力和科研思维的重要手段，积极开展综合设计性实验教学研究，提升学生创新能力，是应用型专业发展和培养技能型人才的需要.