翼状胬肉中IGF-2与COX-2的表达及相关性

陈硕然，李红玉，安 宁，王庚午，孙兆义

(1.牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011；2.南部战区海军第一医院，广东 湛江 524000；3.牡丹江医学院附属红旗医院眼三科，黑龙江 牡丹江 157011)

翼状胬肉是眼部结膜组织受外界刺激而引起的一种慢性炎症增生性眼表疾病。翼状胬肉多发生在室外工作者，常常影响外观，也可能会破坏泪膜引起干眼，且逐渐增生的组织接近瞳孔区时会导致视力下降，对患者的生活水平有一定的影响。IGF-2是对细胞增殖及凋亡影响较大的一类指标，且IGF-2的过表达通常与预后不良有关[1]。COX-2是负责致炎物质前列腺素合成的限速酶[2]，其中炎症的微环境诱导细胞增殖和癌症侵袭[3]。翼状胬肉作为一类组织过度增殖性疾病，对其细胞增殖情况的研究则更为重要。本研究的目的是通过观察正常结膜组织、原发性和复发性胬肉组织中IGF-2及COX-2表达水平的差异，旨在进一步探讨原发性和复发性翼状胬肉中IGF-2及COX-2二者表达的相关性，为本病的发病机制提供理论依据，以及预防、治疗、防止术后复发提供重要的研究价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年11月至2020年10月间于牡丹江医学院附属红旗医院一分院眼科行胬肉切除的患者55例55眼，其中原发性翼状胬肉(原发组)35例35眼，复发性翼状胬肉(复发组)20例20眼。男26例，女29例(年龄在43～67岁之间)。病例纳入标准：单侧翼状胬肉均位于鼻侧；胬肉头部侵入角膜大于3.0 mm；所有受试者均知情同意并接受相关检查，排除其他眼表疾病；无眼部手术、外伤史；无眼部近期用药史；无假性翼状胬肉。正常结膜组选取患有结膜松弛症的白内障囊外摘除患者10例10眼，男5例，女5例(年龄在42～68岁之间)，于近翼状胬肉发生区位置的角膜缘获得正常结膜组织。取材前均经患者知情同意。

1.2 试剂兔抗人IGF-2单克隆一抗抗体(稀释度1∶50)、兔抗人COX-2多克隆一抗抗体(稀释度1∶50)购自美国SAB公司、DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学染色术后组织标本采用4%甲醛固定，经石蜡包埋、切片等处理，进行染色步骤。切片于65 ℃恒温箱下烘烤2 h以上，进行二甲苯及梯度酒精脱蜡、3%过氧化氢10 min、柠檬酸钠煮沸15 min抗原修复操作，PBS冲洗，滴加5% BSA后37 ℃烘干箱封闭1 h，擦干后滴加IGF-2及COX-2一抗，4 ℃冰箱保存过夜。每张切片用PBS清洗，滴加二抗，37 ℃孵育1 h，后PBS冲洗，DAB试剂显色5 min，苏木素复染10 min，盐酸乙醇及蒸馏水洗片，梯度酒精及二甲苯脱水，中性树脂封片，正置显微镜观察。每次实验均设置染色对照，将已知阳性切片作为阳性对照，选用PBS代替一抗作为阴性对照，其余实验步骤不变。

1.4 染色结果判定染色结果以细胞质内出现棕色颗粒作为阳性表达，切片在光镜下随机选择5个高倍视野，计算阳性率，即5个高倍视野下阳性细胞数占细胞总数的比率并取平均值。根据阳性细胞率以及阳性细胞着色强度分数相加之和作为判定标准[4]，高倍视野中阳性细胞率：<5%记为0分、6%～25%记为1分、26%～50%记为2分、51%～75%记为3分、76%～100%记为4分。5个视野平均阳性细胞着色强度：无阳性染色记为0分、浅黄色记为1分、深黄色记为2分、棕黄色记为3分。二者得分相加，可以确定综合得分：0～3分为阴性、4～5分为弱阳性(+)、6～7分为强阳性(++)。

1.5 统计学分析所有数据使用SPSS 25.0软件分析，组间率比较采用卡方检验，IGF-2与COX-2之间表达相关性采用Spearman等级相关检验，用r表示(其中0<|r|≤0.19为极低相关性；0.20≤|r|≤0.39为低度相关性；0.40≤|r|≤0.69为中度相关性；0.70≤|r|≤0.89为高度相关性；0.90≤|r|≤1.00为极高相关性)。P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 IGF-2在三组中的表达情况显微镜下结果显示，IGF-2在翼状胬肉组织中阳性染色主要定位于上皮层的细胞质内，且复发组表达强于原发组，而在正常结膜组中呈阴性表达(图1)。IGF-2在原发组和复发组中的阳性表达率分别为54.3%和85%，明显高于正常结膜组(0%)，各组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 IGF-2在三组中的表达情况

图1 IGF-2在三组中的表达情况(×400)

2.2 COX-2在三组中的表达情况显微镜下结果显示，COX-2在翼状胬肉组织中的阳性染色主要定位于上皮层中的细胞质中，且复发组表达强于原发组，在正常结膜组中仅在部分上皮层呈阳性表达(图2)。COX-2在原发组和复发组中的阳性表达率分别为65.7%和90.0%，明显高于正常结膜组(10%)，各组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 COX-2在三组中的表达情况

图2 COX-2在三组中的表达情况(×400)

2.3 IGF-2与COX-2在翼状胬肉中表达的相关性Spearman等级相关检验分析显示，IGF-2与COX-2在翼状胬肉表达中呈中度正相关性(r=0.513)，具有显著统计学差异(P<0.01)，见表3。

表3 IGF-2与COX-2在翼状胬肉中的相关性表达

3 讨论

翼状胬肉是眼科门诊最常见的眼表疾病之一，多表现为颞侧球结膜向角膜生长的纤维血管样组织，是种易受外界刺激而引起的慢性炎症增生性疾病，在全球发病率约为12%[5]。目前多项研究证实[6]，暴露在室外的人群高发，是由于室外活动人群接触紫外线较多且受风沙、粉尘的影响。有学者研究认为[7]，紫外线的照射可以引起角膜缘干细胞屏障的损伤，还可导致结膜组织中多种因子表达从而引发蛋白结构的改变。此病发病机制复杂，病因多包括环境因素、病毒感染、氧化应激损伤、增殖与凋亡、炎症与免疫机制、角膜缘干细胞缺陷[8]，其中的增殖与凋亡机制越来越引起广泛学者的关注重视。IGF-2也被称为生长调节素，是一种蛋白质类激素，属于胰岛素家族的成员，位于11p15.5号染色体上[9]，属于最早发现的印迹基因之一。基因印迹是指来自父亲或母亲的遗传基因在子代遗传上进行不对称选择而导致单等位基因表达的现象，多通过表观遗传机制以DNA差异性甲基化为主来完成。人类IGF-2基因仅从父系遗传的等位基因中表达，IGF-2因子参与调控细胞增殖及恶性转化，也与细胞黏附、生长、分化、迁移等相关。国内外学者研究发现[10-11]，IGF-2在许多肿瘤组织中均存在高表达，如胃癌、大肠癌、肝癌、膀胱癌等，IGF-2可以通过以下几种途径促进肿瘤的发生和发展[12]：促增殖作用、抑制凋亡、IGF-2可直接或间接通过增加VEGF的合成促进肿瘤血管形成、增强基质金属蛋白酶-2的表达[13]。翼状胬肉作为一种组织炎性增殖性疾病，而IGF-2作为细胞增殖及凋亡影响较大的一类指标，推测其可能与翼状胬肉疾病的发病机制相关。COX-2作为已知的诱导肿瘤血管生成的关键分子，参与许多肿瘤中的发生、发展，可能的途径包括：促进前列腺素2合成、抑制调亡、改变细胞附着于底物的能力、抑制DNA修复[14]，其中COX-2也参与眼部疾病的炎症发生和新生血管形成。已有研究证实[15]，原发性翼状胬肉上皮中存在COX-2阳性表达，这也同样解释了翼状胬肉炎性增殖的行为。

本研究结果显示，IGF-2及COX-2在原发组和复发组中呈阳性表达，明显高于正常结膜组织，且复发组表达强于原发组，表明了两种因子参与了翼状胬肉疾病的发生过程。本研究通过Spearman等级相关分析得出，IGF-2与COX-2的表达具有正相关性，提示两者在翼状胬肉的发展中具有协同关系。通过以上研究论述，我们发现了IGF-2及COX-2在翼状胬肉的发病机制中具有重要的意义。在临床中，减少翼状胬肉细胞中的IGF-2及COX-2的表达，可有助于抑制翼状胬肉的发展并降低其术后复发率，对预防和治疗翼状胬肉提供了重要参考价值。