吉西他滨对NK/T细胞淋巴瘤裸鼠模型的影响

李 冀，于成龙，赵 玉，刘赫迪，于建渤

(1.黑龙江省肿瘤疾病防治重点实验室；2.牡丹江医学院附属红旗医院病理诊断中心，黑龙江 牡丹江 157011)

光学分子影像学技术能够实时监测肿瘤模型中肿块的生长、侵袭及转移情况，同时对抗肿瘤药物疗效做出评定[1-3]。活体成像技术是对发生在活体内的各种生物现象进行无创性可视化的分析方法。近年来，具有分子水平成像能力的图像诊断技术在医学领域得到了长足的发展[4]。本研究拟构建NK/T细胞淋巴瘤裸鼠模型，旨在探讨生物发光物质在NK/T细胞淋巴瘤裸鼠模型中的变化，并探索吉西他滨用药后光学分子影像学技术在淋巴瘤诊疗的新应用。

1 材料与方法

1．1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雌性BALB/C裸鼠10只，4～5周龄，体重8～10 g，北京维通利华实验动物中心提供。饲养在SPF级超净层流室，恒温(24～26 ℃)饲养，垫料、笼具、饲料及饮水均经过高压灭菌和紫外线照射处理。

1.1.2 材料 细胞株 NK92-Luc购自美国 ATCC 公司；RPMI-1640 培养液和胎牛血清购于美国Gibco 生物公司；人白细胞介素-2 (IL-2) 购于 R&D公司；萤火虫荧光素酶D-Luciferin 购自美国Selleck生物科技公司；异氟烷购自湖北鸿运隆生物公司。

1.1.3 仪器设备 小动物活体成像仪Berthold Technology-NightOwl LB983；倒置荧光显微镜为尼康 TS100-F。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 NK92-Luc细胞培养在含10% FBS、1% PBS、89% RPMI-1640、100 U IL-2及1.5 μg/mL嘌呤霉素培养基中，培养瓶放入37 ℃、5%CO2恒温培养箱。根据细胞生长情况，更换培养液，取对数期细胞进行实验。

1.2.2 NK92-Luc细胞体外生物发光活性检测 取对数生长期的NK92-Luc细胞悬浮于4 mL RPMI 1640培养液中，100 μL/孔接种于96孔板中，调整细胞数量分别为每孔100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600个，每孔设置两个复孔，共3组；其中两组每孔加入1 μL荧光素酶底物 (15 mg/mL)；另一组不加荧光素酶底物作为阴性对照。静置5 min，小动物活体成像仪Berthold Technology-NightOwl LB983检测NK92-Luc细胞体外发光情况，分析发光强度和细胞数之间的关系。

1.3 NK92-Luc裸鼠皮下肿瘤模型的构建及鉴定

1.3.1 构建NK92-Luc淋巴瘤裸鼠皮下肿瘤模型 取对数生长期NK92-Luc细胞悬液，移入15 mL离心管，离心 (1000 r/min，5 min)，弃上清；PBS洗涤两次，适量PBS重悬，细胞计数板计数，按照1×107个细胞/只接种密度，配置细胞悬液；将裸鼠固定在超净工作台中，75%乙醇消毒裸鼠左侧季肋皮肤，按每只100 μL肿瘤细胞悬液(含1×107个细胞)接种于裸鼠左侧季肋皮下，观察裸鼠饮食水、活动正常，2～3 d后于左季肋部观察到米粒大小隆起，此为建模成功。

1.3.2 小动物活体成像 将NK92-Luc裸鼠肿瘤模型随机分为对照组(PBS组)，实验组(吉西他滨组)。对照组：每隔两天皮下注射100 μL/只PBS；实验组：每隔两天皮下注射100 μL/只吉西他滨(含吉西他滨50 μg)。首次给药前及给药后第5天、第8天、第11天用小动物活体成像仪Berthold Technology-NightOwl LB983成像分析。方法：腹腔注射50 μL荧光素酶底物(1 mg/mL)，记录注射荧光素酶底物时间；注射荧光素酶第7 min时将裸鼠放入麻醉箱中进行异氟烷吸入性麻醉，注射荧光素酶第9 min时将实验组放入活体成像仪暗箱平台成像；采用仪器配备的indigo软件对图像和数据进行分析处理，统计分析肿瘤治疗后发光强度(参数：曝光时间5 min/次)。

1.3.3 肿瘤体积测量 使用游标卡尺于给药前及给药后第5天、第8天、第11天测量两组裸鼠肿瘤最长径和最短径，计算肿瘤体积(体积=1/2长径×短径2)；绘制裸鼠肿瘤动态生长曲线。

1.3.4 HE染色鉴定肿瘤 处死小鼠，取肿块部位，放入10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，苏木素-伊红(HE)染色，显微镜下观察。

1.4 统计学分析应用 SPSS 23.0统计软件，计量资料以“均数±标准差”表示，行t检验，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NK92-Luc培养和形态学观察结果在显微镜下，NK92-Luc细胞在培养基中悬浮生长，成簇生长，细胞呈圆形、类圆形(见图1)。

图1 NK92-Luc细胞形态(A：×40；B：×200)

2.2 NK92-Luc细胞体外生物发光活性检测用荧光素酶检测NK92-Luc细胞发光活性(图2)，生物发光活性与细胞数呈正比(图3)。

图2 NK92-Luc细胞发光活性)

图3 生物发光强度与NK92-Luc细胞数量关系

2.3 吉西他滨对裸鼠肿瘤生长的影响

2.3.1 两组活体成像结果 注射后第3天肉眼未见明显肿块，但是生物发光成像已经可以检测到皮下肿瘤细胞的生物发光信号：随着时间延长，生物发光信号显示肿瘤的体积逐渐增大；实验组肿瘤体积小于对照组体积，见图4。

图4 两组裸鼠肿瘤生长情况的活体成像图

2.3.2 两组肿瘤体积结果 随着时间延长，两组裸鼠肿瘤体积逐渐增大。给药后5 d、8 d、11 d对照组肿瘤体积大于实验组，差异具有显著性(P<0.05)，见表1。

表1 两组肿瘤体积变化(cm3)

2.4 HE染色结果肉眼所见，瘤体为圆形或类圆形肿块，肿瘤外周有纤维组织包绕，切面灰红灰白、鱼肉状，质嫩较脆，易出血。HE染色见明显的淋巴样细胞增生，呈弥漫性生长、常累及血管，见图5。

图5 裸鼠皮下肿瘤HE染色结果(A:×100, B:×400)

3 讨论

淋巴瘤是淋巴细胞及其前体细胞克隆性增生而形成的一类肿瘤，也是机体免疫系统的免疫细胞发生的一类肿瘤，可原发于淋巴结和结外淋巴组织。其来源于血液淋巴系统的恶性肿瘤,是世界范围内十大恶性肿瘤之一。亚洲人群多见，外周T细胞淋巴瘤为我国发病最常见类型，约占1/3。最常累及上呼吸道附近，其它包括皮肤、肠道等。成人为主，男性较女性多见[5]。随着社会发展，淋巴瘤发病年龄呈明显年轻化趋势，发病率逐年上升，5年生存率不足50%[6]。

活体生物发光成像技术是一种新型影像检测技术。生物发光现象依赖于酶与底物相互作用产生的一种化学变化，采用荧光素酶，底物随荧光素酶(例如D-荧光素酶)的类型而变化[7]。此技术，为研究肿瘤生物学和治疗提供了一种科学方法[8]。近年来，活体生物发光成像技术在生命科学中的多种领域被广泛应用，现已成为研究实验动物通用工具之一[9]。此技术能够无创、连续、时时监测肿瘤的变化，为相关动物实验的研究提供科学依据[10]。

吉西他滨(Gemcitabine)是一种胞嘧啶核苷类似物，现已被广泛应用于临床治疗，临成为床一线化疗药物之一对多种癌症具有明显的抗肿瘤作用。本研究选择NK92-Luc 细胞，采用左侧季肋皮下接种的方式构建裸鼠皮下肿瘤，4 d后于左季肋部观察到米粒大小隆起，成功建立肿瘤模型；采用测量体积的方式观察肿瘤的生长情况；在给药后第5、8、11天通过小动物活体成像仪观察肿瘤生物发光成像情况。发现随着吉西他滨治疗时间增加，实验组裸鼠肿瘤体积明显小于对照组。说明吉西他滨对肿瘤的生长起到了抑制作用。本实验也证明利用生物发光成像技术，对进一步研究肿瘤的发生发展提供了简单方便可行的方法。综上所述，本研究以NK92-Luc 细胞、裸鼠皮下肿瘤模型为研究对象，成功构建裸鼠皮下肿瘤模型，通过活体成像技术，动态观测肿瘤的发展变化，初步探索 NK/T 细胞淋巴瘤诊断新方法，具有重要的科学价值和临床意义。