Neuroligin-1细胞外域的表达、纯化与鉴定

苏晓男，毕鹏翔，2，黄 青，于欣洋，吴 丹，3，郭艳芹，2

(1.牡丹江医学院；2.牡丹江医学院附属红旗医院神经内一科；3.牡丹江医学院医药研究中心，黑龙江 牡丹江 157011)

阿尔兹海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种慢性神经系统退行性疾病，以进行性认知能力下降、人格改变、记忆力衰退为主要临床特征。2030年，我国AD患者即将达到1500万，成为世界上AD患病人数最多的国家[1]。因目前AD的治病机理尚不明确，如何防治AD，成为目前亟待解决的世界难题。AD的标志性病理特征包括细胞外β淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉积形成的老年斑。突触丢失在AD患者早期出现，并与认知功能下降有关[2-4]。NL1是一种突触后粘附蛋白，在突触的成熟、维持、形成和可塑性中扮演重要角色[5-7]，随着NL1研究的逐渐深入，人们发现Aβ寡聚体可以直接与NL1细胞外域(1-691aa)相互作用，引发AD。

本研究利用DNA重组技术构建NL1/1-691诱导型原核表达重组质粒，后将重组质粒转化至大肠杆菌感受态C43中诱导表达，摸索优化诱导表达条件，筛选能够稳定表达的表达载体。实验中采用pGEX-6P1质粒，其结构特点是分子量较小，编码抗氨节青霉素抗性序列、强启动子tac和编码谷胱甘肽转移酶(GST，分子量约为26 kDa)的纯化标签。后续多克隆位点可以插入DNA片段，融合蛋白产物纯化方法简单快速，在细菌中产生的融合蛋白一般以可溶状态存在，不形成包涵体。另GST蛋白亲和纯化层析具有载量高、非特异性吸附少，流速快等特点。为提高可溶表达量，本实验对诱导温度、诱导时间、诱导浓度及IPTG加入时机进行了优化，通过实验确定最佳诱导条件，成功表达外源蛋白。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器(1)主要实验试剂：大肠杆菌感受态细胞C43(上海唯地生物技术公司)；引物由金唯智生物科技有限公司合成；质粒小提试剂盒、DNA回收试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)；限制性核酸内切酶XhoI、BamHI(Thermo Scientific公司)；酵母提取物、蛋白胨(英国Oxoid公司)；氯化钠(Solarbio公司)；GST-tag Purification Resin(BeyoGold公司)。洗脱缓冲液：250 mM Tris Hcl，150 mM HCL，15 mM GSH，pH 8.0。兔抗GST-tag单克隆抗体(Thermo Scientific公司)；蛋白分子量Marker (Bio-rad公司)；ECL化学发光显色试剂盒(biosharp公司)；(2)主要仪器：SDS-PAGE多功能电泳仪：美国BIO-RAD公司；全自动高压蒸汽灭菌锅等。

1.2 pGEx-6P1-NL1/1-691原核表达载体的构建及纯化

1.2.1 pGEx-6P1-NL1/1-691原核表达载体的构建 查找GeneBank数据库中NL1/1-691基因序列，委托苏州金唯智生物科技有限公司常规合成目的基因，并针对大肠杆菌的密码子对表达质粒进行了目的基因序列优化，添加5'BamHI、3'XhoI酶切位点，选择pGEx-6p1蛋白表达载体，构建质粒pGEX-6p-1-NL1/1-691，使用SnapGene软件绘制质粒图谱。取重组质粒1 μL加入50 μL C43感受态中转化。挑取克隆于1 mL含有氨苄青霉素抗性LB培养基中37 ℃活化16 h，进行菌液PCR验证，反应体系为2×Taq PCR Mastermix 7.5 μL，ddH2O 6 μL，引物前后各0.5 μL，菌液0.5 μL，1%琼脂糖核酸凝胶电泳检测，反应条件为：150 V恒压，25 min左右，凝胶成像分析系统成像。

1.2.2 重组质粒的转化及阳性克隆的筛选 使用质粒小提试剂盒从菌液中提取质粒，进行质粒及质粒双酶切验证，反应体系为pGEX-6p-1-NL1/1-691质粒42 μL，绿色10×Buffer 5μL，BamHI、XhoI各1.5 μL，共50 μL体系37 ℃恒温培养45 min。1%琼脂糖核酸凝胶电泳检测，反应条件为：150 V恒压，25 min左右，凝胶成像分析系统成像。

1.2.3 NL1/1-691诱导表达条件的优化 取重组质粒pGEX-6p-1-NL1/1-691 1 μL加入50 μL C43感受态中转化，42 ℃热激90 s，冰上静置2 min，加入500 μL无抗培养基，37 ℃ 180 rpm水平摇床震荡70 min，后涂布至含有100 μg/mL氨苄青霉素平板上，37 ℃恒温培养过夜。第二日，挑单个菌落于含有100 μg/mL氨苄青霉素LB培养基中(100 μg/mL)，37 ℃、180 rpm过夜，按1:200比例转接到100 μg/mL(A+)LB培养基中，当OD值达到0.6左右时，分别加入0.1、0.3、0.5 mmoL/L IPTG 诱导2 h、3 h、4 h，16 ℃、25 ℃、37 ℃培养过夜，次日收集菌体，沉淀使用10 mL PBS重悬，超声破碎、4 ℃离心，收集上清液过GST亲和纯化层析柱，GST标签纯化树脂用PBS清洗两次。分别收集破碎后全菌3 μL、离心后上清15 μL、过柱流穿液15 μL、清洗后Beads 15 μL，加15 μL SDS上样缓冲液，煮沸10 min，15% SDS-PAGE检测，筛选最佳诱导表达条件。(1)tNL1诱导表达时机的优化：挑取阳性克隆至5 mL氨苄抗性LB培养基中，37 ℃、180 rpm活化过夜，次日按1:200接菌至1000 mL A+培养基中，37 ℃分别水平摇床震荡菌2 h、3 h、4 h后降温至25 ℃，加入0.5 mmoL IPTG诱导过夜16 h，按上述方法处理及检测。(2)tNL1诱导表达温度的优化：挑取阳性克隆至5 mL氨苄抗性LB培养基中，37 ℃、180 rpm活化过夜，次日按1:200接菌至1000 mL A+培养基中，37 ℃水平摇床震荡3 h，分别降温至16 ℃、25 ℃、37 ℃后加入0.5 mmoL IPTG诱导过夜16 h，按上述方法处理及检测。(3)tNL1 IPTG诱导浓度的优化：挑取阳性克隆至5 mL氨苄抗性LB培养基中，37 ℃、180 rpm活化过夜，次日按1:200接菌至1000 mL A+培养基中，37 ℃水平摇床震荡3 h，降温至25 ℃后分别加入0.1 mmoL IPTG、0.3 mmo IPTG、0.5 mmoL IPTG诱导过夜16 h，按上述方法处理及检测。

1.2.4 pEGx-6p1-NL1/1-691纯化 按照上述纯化方法、以最佳诱导条件进行诱导，收集后的菌液4500 rpm、离心15 min，收集菌体，10 mL PBS重悬菌体，加入1 mmoL DTT、2 mmoL PMSF，后超声破碎，14000 rpm离心40 min收集上清，将上清过GST亲和纯化层析柱(时间>1 h)，2 mL PBS清洗3次，分别取超声破碎后全菌、离心后上清、过柱流穿液、GST标签纯化树脂样品，将纯化后样品SDS-PAGE。蛋白洗脱：GSH洗脱缓冲液(250 mM Tris Hcl，150 mM HCL，15 mM GSH，pH 8.0)，5 min吹打1次，每次半小时取流穿液共4次(总时长2 h)，得到带GST标签的目的蛋白。

1.2.5 Western blot检测NL1/1-691蛋白 将NL1/1-691蛋白样品Western blot，条件为80 V恒压30 min转为120 V，切相应大小胶体蛋白印迹转移至PVDF膜上，150 mA恒流90 min，5%脱脂奶粉室温封闭60 min，加入一抗(1:1000比例稀释)，4 ℃孵育过夜，次日使用1×TBST清洗PVDF膜3次，每次10 min，加入二抗(1:10000比例稀释)孵育60 min，TBST清洗PVDF膜3次，将膜用ECL发光试剂显色，超灵敏多功能成像仪成像。

2 结果

2.1 pGEx-6p-1-NL1/1-691质粒构建使用SnapGene软件绘制质粒图谱，图中显示目的基因片段、GST亲和纯化标签、5'BamHI and 3'XhoI酶切位点、载体pGEX-6p-1(氨苄青霉素抗性)，如图1所示。

图1 pGEx-6p-1-NL1/1-691质粒中目的片段、载体、酶切位点结构示意图

2.2 pGEx-6p-1-NL1/1-691重组质粒菌液PCR及双酶切鉴定NL1/1-691细胞外全长片段2073 bp，优化目的基因并转化感受态细胞，菌液PCR验证。图中第1、2、4道无明显条带，为阴性克隆；3、5道有明显的与目标大小一致条带，为阳性克隆(图2)。挑取其中一个阳性克隆培养，提取质粒，使用XholI、BamHI对质粒进行双酶切后，琼脂糖凝胶电泳验证结果显示：DNA片段有相应条带，原核表达载体构建无误(图3)。

图2 pGEx-6p-1-NL1/1-691蛋白菌液PCR鉴定

图3 pGEx-6p-1-NL1/1-691质粒、双酶切鉴定

2.3 NL1/1-691蛋白的诱导表达与纯化

2.3.1 NL1/1-691蛋白诱导条件检测 本实验室成功构建pGEx-6p1-NL1/1-691原核表达载体，经优化诱导表达条件后，重组蛋白以包涵体形式表达，全菌表达量较高、上清表达微弱。由于包涵体蛋白纯化难度较大，变性复性多因素不可控，因此本研究按照可溶性表达提取目的蛋白。另诱导时机、诱导剂浓度的选择对于蛋白表达有很大影响，菌液培养时间不同，OD 600 nm值不同[8]。摸索纯化条件，SDS-PAGE显示，表达的蛋白主要位于103 kDa左右。37 ℃培养3 h(图4)后降温到25 ℃(图5)、加0.5 mmoL/L IPTG(图6)诱导时表达量最高，并与目的蛋白大小一致。

图4 不同诱导时间对NL1/1～691表达的影响

图5 不同温度对NL1/1～691蛋白表达的影响

图6 不同浓度IPTG对NL1/1～691蛋白表达的影响

2.3.2 重组蛋白的纯化与洗脱 按照上述摸索条件GST亲和层析法纯化重组蛋白，使用GSH蛋白洗脱缓冲液洗脱蛋白4次并收集，SDS～PAGE结果分析：经GST纯化成功得到NL1/1～691重组蛋白(图7)。

图7 重组蛋白的纯化、洗脱

2.3.3 重组蛋白Western blot鉴定 由于蛋白表达载体pGEx-6P1可使pGEx-6p-1-NL1/1-691重组蛋白带GST亲和标签，Western blot鉴定时一抗选择兔抗GST标签，二抗选择羊抗兔。经SDS蛋白凝胶电泳、转膜后分析结果表明：蛋白可被抗原特异性结合，且大小与目的蛋白一致，在103 KDa左右(图8)，原核表达载体构建成功。

图8 重组蛋白抗原性检测

3 讨论

近期研究显示，AD的早期认知能力下降与突触丢失有关[3-4]。NL-1最初被关注是因其细胞外结构域与乙酰胆碱酯酶同源[9]，但缺乏一个关键残基，现被证明其也是神经突触黏附对(Neuroxin-Neuroligin)中重要的一员。在兴奋性突触中，当Aβ释放到突触间隙时，会与突触后膜上的NL-1结合，结合后将引起更多Aβ寡聚体的局部聚集，最终影响突触后区域，引发AD。虽然Aβ1-42寡聚体治病机理目前在分子水平上尚不十分清楚，但NL1可能为Aβ寡聚体的靶向蛋白。本实验成功构建并检测表达了NL1/1-691重组蛋白，下一步将研究NL1/1-691蛋白对Aβ诱导的海马神经元细胞突触功能的影响。最初的蛋白纯化过程NL1/1-691呈包涵体表达，因包涵体纯化较为复杂，变性复性较难掌握，我们在实验中尽量降低包涵体的生成[10-11]。通过25 ℃诱导后不断改进IPTG浓度：0.1 mmoL/L、0.3 mmoL/L、0.5 mmoL/L，筛选出最佳IPTG浓度为0.5 mmoL/L。经过对IPTG浓度、时间、温度等条件的摸索，成功表达并纯化出高纯度的重组蛋白NL1/1-691。本课题使用GST融合蛋白，释放出天然结构的NL1/1-691，保留了琼脂糖极好的亲水性及大网架结构，与生物活性大分子有很好的相容性，具有载量高、非特异性吸附少，流速快等特点。本实验构建NL1/1-691原核表达载体，使用可溶性蛋白纯化方法得到重组蛋白，其表达量较低，后续大量纯化后可过离子交换柱或凝胶柱来富集目的蛋白，同时去除GST标签。下一步实验将重组蛋白应用于细胞功能实验，为研究阿尔兹海默病治疗提供新理论基础。

4 结论

本实验成功构建NL1/1-691原核表达载体，NL1/1-691蛋白最佳纯化条件为：25 ℃培养2 h加IPTG诱导为最佳诱导时机，IPTG诱导浓度为0.5 mmol/L，最佳诱导时间为12 h。