β-连环素蛋白预测分化型甲状腺癌转移的价值

冯铎， 徐菲， 刘尧， 邹天辉， 王寰昱， 邹家威

甲状腺癌是临床常见的内分泌系统恶性肿瘤，具有生长缓慢及恶性程度低等特征，早期无明显症状；中晚期可表现为肿块质硬、吞咽困难、声带压迫及颈交感神经结节受压等症状，影响患者的生活质量[1-2]。流行病学调查显示，约90%的甲状腺癌为分化型甲状腺癌(differentiated thyroid carcinoma, DTC)，其病因较为复杂，与癌细胞生长因子、电离辐射、家族遗传史及雌激素过量分泌等有关[3-4]。临床治疗DTC以手术切除为主，但仍有部分患者出现预后不良[5]。研究发现，癌细胞转移是DTC预后不良的独立影响因素[6]。通过超声检查、甲状腺球蛋白检测可判定DTC的复发、转移情况，但甲状腺球蛋白水平易受到甲状腺球蛋白抗体及促甲状腺激素等因素的干扰，准确度受限；超声检查因图像清晰度及肿瘤边界模糊等原因也易造成误诊、漏诊[7-8]。因此寻找有效的指标评估DTC转移情况、制定治疗方案及改善生活质量具有重要意义。β-连环素蛋白为细胞内可溶性蛋白，其在介导细胞黏附、参与信号转导及调控组织形态等方面具有重要的生理功能，在胃癌、前列腺癌及乳腺癌等疾病的发生、发展及转移中起重要作用[9-10]，但关于DTC细胞转移的研究相对较少。本研究通过检测DTC组织中β-连环素蛋白的表达情况，探讨β-连环素蛋白预测DTC转移的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年2月至2019年10月华中科技大学协和深圳医院收治的423例DTC患者，纳入标准：①经影像学、术后病理学检查等手段确诊为DTC；②首次诊断为DTC，且未经手术、化疗等系统治疗；③年龄18～75岁；④临床资料齐全。排除标准：①患有自身免疫系统疾病及凝血功能障碍者；②合并有其他器官恶性肿瘤者；③合并心脏、肝及肾等器官衰竭者；④合并甲状腺囊肿、甲状腺炎等甲状腺疾病；⑤不配合病理组织采集或已放弃治疗者。本组患者中男123例，女300例；组织学类型：乳头状癌297例，滤泡癌126例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期232例，Ⅲ～Ⅳ期191例。根据术后病理结果，将患者分为转移组(73例)和未转移组(350例)，转移组患者中有37例颈部淋巴结转移，19例纵隔淋巴结转移，10例肺转移，6例骨转移，1例脑转移。本研究方案经我院伦理委员会审核批准，患者及其家属同意并签署知情同意书。

1.2 基线资料收集 研究人员自行设计调查问卷，从电子病例系统中收集患者性别、年龄、肿瘤直径、组织学类型、TNM分期、腺外侵犯及病灶位置等临床病理资料，双人复核，确保采集数据的可靠性和准确性。

1.3 免疫组化法检测β-连环素蛋白表达 于术前用穿刺法采集DTC组织样本，样本不得出现渗血或缺血坏死等情况，用4%甲醛溶液固定，包埋DTC组织，制成厚4 μm的切片；用不同浓度乙醇水溶液脱蜡水化，3%过氧化氢水溶液封闭内源性过氧化氢酶，微波中、高、低火修复抗原；加入鼠抗人β-连环素蛋白单克隆一抗(上海晅科生物科技有限公司)，37 ℃孵育2 h，弃去一抗后滴加二抗，37 ℃孵育40 min，弃去PBS缓冲液(北京百奥莱博科技有限公司)。在备用样品中加入DAB显色剂(北京百奥莱博科技有限公司)避光显色3～5 min，苏木精染色5 min，脱水至透明色后采用中性树胶封片，由高年资经验丰富的医护人员双盲法判断：在400倍显微镜(广州市巨璟仪器有限公司)下任意选择切片的10个视野，每个视野计数100个细胞，染色程度判定标准：0分，几乎无着色；1分，浅黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。阳性细胞率判定标准：0分，阳性细胞率<10%；1分，阳性细胞率10%～25%；2分，阳性细胞率26%～50%；3分，阳性细胞率>50%。根据染色程度和阳性细胞率的评分乘积判定β-连环素蛋白表达情况：≤2分为阴性表达，>2分为阳性表达[11]。

2 结果

2.1 β-连环素蛋白表达情况 免疫组化结果显示，β-连环素蛋白在DTC组织中主要表达于细胞膜上，呈棕黄色，见图1。

图1 β-连环素蛋白在分化型甲状腺癌组织中的阳性(1A)及阴性(1B)表达图(免疫组化 ×200)

2.2 β-连环素蛋白表达与患者临床病理特征的关系 β-连环素蛋白表达与肿瘤直径、TNM分期及腺外侵犯相关(P<0.05)，与性别、年龄、组织学类型及病灶位置无关(P>0.05)，见表1。

表1 β-连环素蛋白表达与分化型甲状腺癌临床病理特征的关系

2.3 转移组与未转移组的临床病理参数及β-连环素蛋白表达水平比较 两组患者的性别、组织学类型、腺外侵犯差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者年龄、肿瘤直径、TNM分期及病灶位置差异有统计学意义(P<0.05)，转移组的β-连环素蛋白表达水平明显高于未转移组，差异有统计学意义(P<0.001)，见表2。

表2 转移组与未转移组患者的临床病理参数及β-连环素蛋白表达水平比较

2.4 β-连环素蛋白对DTC转移的诊断效能 以病理组织学诊断为金标准，β-连环素蛋白评分为检验变量，DTC有无转移为状态变量，以“敏感度”为Y轴，“1-特异度”为X轴绘制ROC曲线(图2)。根据ROC曲线，β-连环素蛋白评分诊断DTC转移的临界值为4.08分，其对应的敏感度为65.75%(48/73)，特异度为69.43%(243/350)，阳性预测值为30.97%(48/155)，阴性预测值为90.67%(243/268)，约登指数为0.352，ROC曲线下面积(AUC)为0.708(95%CI：0.645～0.772)，具有一定的预测价值。

图2 β-连环素蛋白评分诊断分化型甲状腺癌转移的ROC曲线

2.5 Logistic回归分析DTC转移的影响因素 以DTC是否发生转移为因变量，以表2中的所有临床病理参数指标和β-连环素蛋白评分为自变量，行多因素Logistic回归分析，结果显示，β-连环素蛋白评分>4.08分、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期及肿瘤直径>1.0 cm是DTC转移的独立危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 Logistic回归分析DTC转移的影响因素

3 讨论

DTC以甲状腺肿大或结节为初始症状，随着癌症的发生、发展，会出现声带嘶哑、吞咽困难及呼吸阻塞等症状[12]。流行病学调查显示，DTC具有发展缓慢、恶性程度低及病程长等特点，因此预后较好，患者10年生存率高达90%，但约有10%的DTC患者会发生肺、骨及脑转移等。DTC骨转移患者的10年生存率为15%左右，是目前DTC患者死亡的主要原因之一[13-14]，因此找寻能有效预测DTC转移的指标，对改善患者生存质量，提高生存率具有重要意义。甲状腺功能指标在初筛甲状腺功能及肿块良恶性方面具有一定优势，但其干扰因素较多，易受甲状腺炎等疾病的影响，且在预测甲状腺癌转移方面的能力有限[15]。β-连环素蛋白是一种多功能结构蛋白，可通过细胞骨架、信号通路传导等方式调控细胞生长、分化及增殖等，且其作为转录因子可在DNA合成中调节相关基因的表达[16]。Leung等[17]研究表明β-连环素蛋白在肝癌中高表达，其可促进肝癌细胞增殖、转移及包膜形成。Shen等[18]研究发现β-连环素蛋白在甲状腺癌组织中异常表达，参与癌细胞的发生发展。而赵文辉[19]研究证实β-连环素蛋白阳性表达患者的5年生存率为87.93%，低于阴性表达患者的91.38%，提示可将β-连环素蛋白应用于甲状腺癌预后的预测。

席雪华等[20]综述20%～90%的患者会发生颈部淋巴结转移，约30%的DTC患者治疗后会出现复发转移，均明显高于本研究中的17.26%(73/423)的转移率，可能与研究样本的选择有关。本研究结果还显示，β-连环素蛋白半定量评分>4.08分、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期及肿瘤直径>1.0 cm是DTC转移的独立危险因素，其中TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者发生DTC转移的概率是Ⅰ～Ⅱ期的1.735倍，TNM分期的评判标准是原发肿瘤位置、淋巴结转移及远处转移的情况，分期越高，癌症细胞恶性程度越严重，预后越差；肿瘤直径与肿瘤大小及负荷紧密联系，肿瘤体积越大，其越容易缺氧，对放、化疗等手段产生天然排斥，降低对DTC的控制程度，易发生转移。β-连环素蛋白作为多功能蛋白，在DTC等恶性肿瘤的发生、发展及转移中发挥重要作用，其可与细胞骨架协同作用，调控细胞的生长、分化及凋亡等过程，同时其可作为DNA翻译过程中的转录因子，促进细胞分裂及增殖基因的表达。β-连环素蛋白作用于DTC转移可能与以下两方面有关：一方面，β-连环素蛋白可通过Wnt/β-连环素蛋白信号转导通路介导甲状腺上皮细胞间充质细胞转化基因的表达，激活原癌基因，促进DTC的转移、分化，影响预后；另一方面，细胞黏附因子能激活β-连环素蛋白信号通路，促进黑色素瘤的增殖、分化，促进DTC发生淋巴结转移、肺转移及骨转移等，严重威胁患者的生命安全[21-22]。王九龙等[23]研究62例DTC患者，表明β-连环素蛋白在癌组织中呈高表达状态，并与淋巴结转移呈正相关，与本研究结果一致。本研究对象仅限于2013年2月至2019年10月期间我院收治的423例DTC患者，在医护水平、治疗方式、患者认知程度等方面的差异可能使试验结果出现偏差，仍需纳入大量多中心样本以验证和补充研究结果。

综上所述，β-连环素蛋白在DTC中异常表达，在预测甲状腺癌转移方面有一定的临床价值，值得进一步研究并推广应用。