PD-1/PD-L1介导的肿瘤免疫治疗的系统回顾及中医药联合的研究展望

陈芝强， 綦向军， 李泽云， 陈国铭， 吴金凤， 孙玲玲， 曹洋， 林丽珠

恶性肿瘤的治疗始终是世界性难题，根据美国癌症学会官方期刊发表的“2018年全球癌症统计报告”数据显示，2018年全球癌症发病人数约为1800万人、死亡人数约960万人[1]。肿瘤的传统治疗方式包括手术、放疗、化疗及生物靶向治疗等，但均有局限性，效果差强人意。随着对肿瘤免疫认识的加深，肿瘤的免疫疗法取得了突破性进展，并在2013年被《Science》评选为年度突破[2]。程序性死亡受体-1(programmed death-1，PD-1，CD279)/程序性死亡配体-1(programmed death-ligand 1，PD-L1，CD274，B7-H1)是肿瘤免疫研究的热点之一，现有研究对PD-1/PD-L1的结构、功能、机制及其对肿瘤微环境的影响等方面进行了深入研究，亦有部分研究探讨了中医药在PD-1/PD-L1通路中的调控作用。本文对PD-1/PD-L1介导的肿瘤免疫治疗及中医药联合治疗的研究现状进行综述。

1 肿瘤的免疫逃逸

生物体内细胞更新与死亡的动态平衡有赖于免疫系统的严格监控。免疫系统通过固有免疫或适应性免疫识别并清除发生突变而恶性增殖的细胞，从而避免肿瘤的发生、发展、侵袭及转移等。然而，由于免疫系统功能的缺陷或缺失，仍有部分突变细胞产生免疫逃逸，进而发展为肿瘤。

肿瘤细胞的特征包括恶性增殖、抵抗细胞死亡、诱导血管生成以及侵袭和转移等。癌细胞在细胞生物功能失调的过程中不断表达正常细胞所不具备的肿瘤新抗原[3]。在正常情况下，免疫系统可以识别肿瘤新抗原并发动一系列免疫事件清除癌变细胞。Chen等[4]用“癌症免疫周期”的概念对该系列事件进行了描述：首先，癌细胞生成的新抗原被树突状细胞(dendritic cells，DCs)等抗原提呈细胞(antigen-presenting cell，APC)捕获并加以处理为主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)以供下游细胞识别；随后，DCs将MCH-Ι类和MCH-Π类分子上捕获的肿瘤新抗原呈递给T淋巴细胞，从而启动和激活T淋巴细胞的特异性抗原反应；最后，聚集的T淋巴细胞浸润肿瘤细胞，通过T淋巴细胞受体(T cell receptor，TCR)与MHC-I结合，从而特异性识别并清除癌细胞；死亡的癌细胞将再次释放抗原供DCs识别，完成免疫循环。癌症免疫周期的实现受到一系列刺激性和抑制性信号的调节，如免疫检查点蛋白PD-1/PD-L1、CTLA4/B7-1提供抑制性信号，而CD-28/B7-1、白细胞介素(IL)-2等提供刺激性信号[5-6]。

肿瘤免疫逃逸是指肿瘤细胞通过各种机制逃避免疫系统的识别和攻击进而生长和转移的现象，是肿瘤生存和发展的策略之一[7]。肿瘤可以通过多种方式产生免疫逃逸，大体可分为两类：①肿瘤的发展进化诱导免疫耐受；②免疫系统效应细胞的激活抵抗[8]。

2 T淋巴细胞的活化

肿瘤的免疫识别很大程度上取决于T细胞对肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的识别。Kevin Lafferty最早提出T细胞活化的双信号模型[9]：第1个信号即T细胞受体与APC加工形成的MHC复合体相结合，当T细胞受体与MHC复合物识别后，T细胞中会出现一系列细胞信号，这些信号将会激活T细胞代谢的关键丝氨酸-苏氨酸激酶途径，进而启动T细胞的增殖、分化[10]；然而，第1个信号并不足以使T细胞正常活化。第2个信号即一系列的共刺激或共抑制信号，此信号将决定T细胞的后期活性[11]。

典型的共刺激分子是未活化的原始T细胞上的CD28分子，CD28与B7-1/B7-2结合可诱导T细胞的进一步活化以及IL-2的产生[12]。若T细胞仅接受第1信号则会进入一种慢性失活状态[13]。与CD28不同，T细胞上尚存在一类共抑制分子，阻止T细胞的激活，如细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(cytotoxic T-lymphocyte antigen-1，CTLA-4)是一个关键的共抑制受体，同样可以与B7-1/B7-2结合，且亲和力强于CD28，通过这种竞争性的结合可以使T细胞仅接受第1信号而失活[13]。CTLA-4的抑制作用是多途径的，有研究表明CTLA-4与T细胞的结合可导致TCR信号通路去磷酸化[14]。此外，CTLA-4缺陷型小鼠在出生后2～3周死于自身免疫反应[15-16]，提示CTLA-4在调节免疫稳态和T细胞耐受方面发挥重要作用。基于上述认识，免疫学家意识到CTLA-4的阻断可产生抗肿瘤的免疫效应[17]。CTLA-4成为了第1个被靶向的免疫检查点受体，并据此设计了两种抗体：Ipilimumab(中文译名：伊匹单抗)和Tremelimumab(中文译名：替西木单抗)，2个Ⅲ期临床研究均显示Ipilimumab能显著提高黑色素瘤患者的总生存率[18-19]。CTLA-4抗体的成功研制为其他免疫检查点疗法的研究提供了先例[17]，以PD-1/PD-L1通路为靶点的单克隆抗体是继CTLA-4肿瘤免疫检查点疗法的巨大突破，本文将对此进行详细阐述。

3 PD-1/PD-L1信号通路

PD-1通过与其配体PD-L1、PD-L2结合向T细胞传递抑制信号，调节T细胞活化、耐受，对维持自身免疫耐受，保护组织免受自身免疫反应损伤具有十分重要的意义，但该途径亦被肿瘤细胞运用而产生免疫逃逸[20]。其中，PD-1/PD-L1途径是介导T细胞耗竭所致肿瘤免疫逃逸的重要共抑制分子途径。

PD-1信号通路在肿瘤免疫中的认识与运用十分曲折。起初免疫学家发现PD-1缺陷的小鼠拥有更高的自身免疫疾病发病率[21-22]，后续对PD-L1的研究发现，相较于正常组织，PD-L1在人类各种肿瘤细胞表面大量表达[23-25]，随着对PD-1/PD-L1功能研究的深入，直到2006年，第一个针对该通路的临床试验启动[26]。此外，γ干扰素(interferon gamma，IFN-γ)被发现可以上调不同肿瘤细胞表面的PD-L1[27]，因此，肿瘤微环境对肿瘤免疫逃逸的作用受到了广泛的关注与认可

3.1 PD-1/PD-L1的结构及其表达

PD-1最先由Ishida等[28]于1992年发现，并证实可以介导细胞凋亡。随后的相关研究表明PD-1是一种由2q37.3染色体上PDCD1基因编码的含有288个氨基酸的跨膜蛋白[29]，包含免疫球蛋白V样结构区、跨膜结构区及细胞内结构区，而细胞内结构区包含免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)及免疫受体酪氨酸开关基序(immunoreceptor tyrosine-based Switch motif，ITSM)[30-31]。PD-1仅在部分活化的T细胞中表达，如效应性T细胞、调节性T细胞Treg，当TCR信号被激活时，PD-1将迅速被诱导并大量表达，此外，在B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突状细胞中亦有PD-1表达[29, 32-33]。

PD-1有2个配体：PD-L1和程序性死亡配体-2(programmed death-ligand 2，PD-L2，CD-273，B7-DC)，均可在肿瘤细胞中表达，但目前研究仅证实PD-1/PD-L1信号通路表现出明显的临床活性，PD-L2或可参与PD-1介导的T细胞抑制，但PD-L2在肿瘤细胞上的表达较少，且尚无确切证据表明PD-1双抗优于PD-1/PD-L1单抗[34-36]。

PD-L1首先由Dong等[37]发现，即B7-H1分子，而Freeman等[38]证实了该分子即为PD-1的配体之一PD-L1。PD-L1与PD-1具有相似的结构，即免疫球蛋白V样结构区、跨膜结构区、细胞内结构区及免疫球蛋白C样结构区，由9p24.1染色体上的8号外显子CD274基因编码，主要表达于T细胞、巨噬细胞、树突状细胞及单核细胞等[37,39-40]，PD-L1在肿瘤细胞中显著高表达，被认为是致使肿瘤免疫逃逸的重要因素。Ⅰ型和Ⅱ型干扰素(IFNs)均可显著上调PD-L1的表达，对人PD-L1启动子的分析表明，PD-L1的表达依赖于IFN调节因子-1(regulatory factor-1，IRF-1)结合位点[41]。早期研究表明PD-L1的表达与JAK2及PI3K-Akt等信号通路有关[42]。

3.2 PD-1/PD-L1的免疫抑制机制

PD-1/PD-L1可以通过多种途径介导免疫抑制作用，其中，PD-1/PD-L1介导的T细胞衰竭是免疫抑制作用发挥的主要方式。T细胞活化后大量表达PD-1，并与PD-L1结合后使PD-1分子位于胞质区的ITIM及ITSM被Src家族酪氨酸激酶磷酸化，并招募胞内的酪氨酸磷酸酶(SHPs)，SHPs去磷酸化下游通路，导致下游PI3K/Akt通路失活，进而下调细胞存活基因Bcl-xl的表达，导致T细胞凋亡；此外，PD-1的激活能抑制RAS/MEK/ERK信号通路，从而阻断细胞周期进展[43-45]；SHPs还可使zeta链相关蛋白激酶70(ZAP70)和蛋白激酶C-θ(PKC-θ)失活，二者均为T细胞活化及IL-2生成所必需的活性物质[46-47]；Dong等[37]发现肿瘤相关的PD-L1可以刺激外周血T细胞产生IL-10介导免疫抑制；PD-L1可以诱导原始的CD4+T细胞转化为Treg，并通过维持这种转换抑制T细胞的正常功能，该途径的发生同样与PI3K-Akt、ERK等通路的失活有关[48]。上述机制可以导致T细胞生存、增殖及细胞因子分泌能力障碍，致使T细胞失活耗竭。

与对T细胞的抑制作用相似，PD-1同样能抑制B细胞的活化，且发生在PD-1与PD-L1结合后，PD-1分子ITSM上的2个酪氨酸被磷酸化，SHP-2分子被募集到PD-1的C-末端并被磷酸化。磷酸化的SHP-2可以使SyK和Igα/β等BCR信号分子去磷酸化，导致下游PI3K、PLCγ2及ERK分子去磷酸化，导致细胞内Ca2+转运障碍及生长周期停滞[49]，与此同时，B细胞分泌抗体的功能也被抑制[50-51]。PD-L1作为肿瘤细胞的一种受体，上述机制成为了肿瘤细胞的“分子屏障”，能有效阻止效应免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤[27]。

3.3 肿瘤微环境在PD-1/PD-L1介导的肿瘤逃逸中的作用

肿瘤微环境指肿瘤发生、发展及转移过程中所处的内环境，主要包括肿瘤细胞、血管系统、细胞外基质、其他非肿瘤细胞及细胞的分泌产物。微环境中的非肿瘤细胞主要包括基质细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞及免疫细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞、肿瘤相关巨噬细胞等)，细胞分泌产物主要有生长因子、细胞因子及趋化因子等[52]。这些细胞及细胞因子在肿瘤微环境中发挥着促进或抑制肿瘤生长的作用，如间充质细胞和成纤维细胞可以分泌肝细胞生长因子、成纤维生长因子、基质金属蛋白酶2(MMP2)及趋化因子CXCL12等促进肿瘤细胞的生存和侵袭[53-54]；而血管内皮细胞能促进血管新生，为肿瘤细胞提供营养[55]。

另外，肿瘤微环境在PD-1/PD-L1通路中也扮演着重要的角色。PD-1/PD-L1途径介导的肿瘤免疫逃逸被描述为“适应性抵抗”，即T细胞识别肿瘤抗原MHC复合物后被激活为肿瘤效应T细胞(effector T cell，Teff)，到达肿瘤部位成为肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TILs)。TILs识别肿瘤抗原后产生IFN-γ等分子，促进PD-L1在肿瘤微环境中的表达。PD-L1与PD-1结合后，通过T细胞抑制信号向肿瘤细胞传递抗凋亡信号，导致T细胞功能失活而得以生存[27]。

3.3.1 肿瘤微环境对PD-1表达的调控 PD-1的表达受到了严格的调控，在未活化的T细胞中基本不表达，仅在TCR接受信号后被迅速诱导，但活化的T细胞进入肿瘤环境后PD-1可以被再次诱导。IL-12和IL-6在转录因子FXO1及核因子(NF)-κB的协助下通过改变PD-1基因的染色质结构及激活STAT3/STATA4来增强PD-1的转录[56-57]。巨噬细胞上的PD-1可被IFN-α所诱导，通过激活JAK/STAT信号通路形成P48/STAT1/STAT2复合物，与PD-1启动子上的ISRE位点结合，从而增强PD-1的转录[58]，此外，IFN-α也可与TCR信号协同促进PD-1的表达[59]。肿瘤微环境对PD-1的作用尚未完全明确，与PD-1调控有关的研究尚少。

3.3.2 肿瘤微环境对PD-L1表达的调控 肿瘤微环境可以通过多种机制诱导PD-L1的表达，增强PD-1/PD-L1通路的信号传递，抑制肿瘤微环境中的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活化，促进免疫逃逸，参与该过程中的主要微环境因素有IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α、细胞生长因子、低氧及外泌体等[60]。本文仅详述IFN-γ对PD-L1表达的调控作用。

IFNs是一种生物活性糖蛋白，具有抗病毒、抗菌及抗肿瘤等活性，IFN-γ属于Ⅱ型IFN家族，主要由CD8+T细胞、NK细胞及巨噬细胞分泌，IFN-γ曾一度被认为具有抗肿瘤活性[61]。然而，随着对IFN-γ研究的深入，免疫学家逐渐了解到IFN-γ对肿瘤免疫逃逸的促进作用。最直接的证据来自对黑色素瘤患者的临床研究，结果显示接受IFN-γ辅助治疗的黑色素瘤患者相较于未接受辅助治疗患者的预后差[62]。一项针对晚期卵巢癌患者的临床试验结果显示，接受IFN-γ+卡铂/紫杉醇方案患者的总生存时间短于单用卡铂/紫杉醇患者[63]。上述研究表明IFN-γ拥有促进肿瘤生存的潜在能力，直到IFN-γ被证明可以诱导PD-L1的表达[64]。

IFN-γ促进PD-L1表达的机制因肿瘤不同而异。在胃癌细胞中，IFN-γ通过JAK2/STAT1/IFR-1信号通路诱导PD-L1表达[65]；在肺癌细胞中，JAK/STAT3和PI3K-Akt信号通路是主要的作用途径[66]；在骨髓瘤细胞中，IFN-γ通过MEK/ERK及Toll样受体信号通路促进PD-L1表达[67]。

3.4 中医药在PD-1/PD-L1介导的肿瘤免疫逃逸中的运用探讨

中医药作为一种重要的补充与替代医学手段被广泛运用于各种肿瘤的治疗，现有研究表明，中医药不仅可以缓解肿瘤患者的临床症状，提高患者的生活质量，还可以缓解放疗、化疗产生的不良反应，延长患者的生存期[68]。近年来随着肿瘤免疫研究的兴起，肿瘤的免疫治疗已从单纯的辅助治疗发展为最有效的方法之一，成为继手术治疗、放疗、化疗及生物靶向治疗后的又一重大突破。中药对肿瘤细胞的起效机制十分复杂，许多中药活性成分具有细胞毒作用，这可能是其作用机制之一。中药的免疫调节能力亦不容忽视，通过增强免疫系统的抗肿瘤免疫功能及改善免疫微环境来抑制肿瘤细胞的生存和转移是中药介导肿瘤免疫的策略[69]。其作用模式见图1。

图1 PD-1/PD-L1通路及中药作用模式图

3.4.1 中药单体/复方对PD-1/PD-L1通路的调控

目前关于中药干预PD-1/PD-L1的研究很少，但一些中药单体或中药复方已经表现出调控PD-1/PD-L1的潜力。动物实验表明黄芪多糖可以抑制黑色素瘤小鼠瘤体的生长，并降低PD-L1和PD-L2的表达水平[70]；在弥漫大B细胞淋巴瘤的体外实验中，人参皂苷Rg3与PD-1抑制剂体外联合使用可以促进T细胞的增殖，降低T细胞的凋亡率，恢复T细胞的活性，且显著优于PD-1单药组[71]；虫草素可以促进肿瘤相关CD4+T细胞的增殖，并抑制PD-1的表达，促进其分泌功能[72]；消瘰丸在体外可降低CD4+T细胞PD-1表达的作用，而促进CD8+T细胞PD-1表达，且消瘰丸与PD-L1阻滞剂联合使用所产生的阻滞作用强于单用PD-L1阻滞剂[73]；健脾化瘀方可上调肝癌术后小鼠的miR-570水平，进而阻断PD-1/PD-L1通路，减少术后的复发与转移[74]；肺积方和黄芪甲苷能显著下调肺癌小鼠肿瘤微环境中的Treg比例并增加CTL比例，并对PD-1/PD-1通路具有一定的阻滞作用[75]；用黄芪、金银花、野菊花、甘草、鬼针草、半枝莲中药提取液灌胃小鼠的脾脏淋巴细胞PD-1表达水平显著降低[76]；芪玉三龙汤被证实可以通过降低肿瘤细胞中PD-1/PD-L1的转录水平进而抑制Lewis肺癌小鼠的肿瘤生长[77]；葛根芩连汤通过重塑肠道微生物菌群从而增强PD-1阻滞剂在结直肠癌中的作用[78]。

3.4.2 中药对Treg细胞的调控 T细胞是在PD-1/PD-L1介导的肿瘤免疫逃逸的核心，而Treg细胞是PD-L1外周耐受的关键因素之一[48]。iT-reg细胞可以显著抑制效应T细胞的活性并抑制自身免疫反应的发生，Treg细胞分为自然调节性T细胞(nT-reg)及适应性调节性T细胞(iT-reg)两种类型。其中iT-reg可被PD-L1持续诱导，PD-L1可以通过磷酸化Akt、mTOR、S6及下调EKR2并上调PTEN，增强和维持Foxp3的表达及iT-reg的抑制作用[48, 79]。因此目前针对Treg细胞的治疗措施可能在PD-1/PD-L1通路中起效。

许多中药的有效成分具有抑制Treg活性的作用。黄芪多糖可以抑制肝癌微环境中Treg细胞的增殖，且具有剂量-时间依赖性，黄芪多糖还可通过CXCR4/CXCL12途径阻断基质细胞衍生因子1(SDF-1)及其受体，从而抑制Treg细胞的迁移[80]；甘草多糖可以显著下调H22荷瘤小鼠微环境中Treg细胞的比例，降低Treg细胞中Foxp3的表达，从而抑制肿瘤生长[81]；灵芝多糖可以增加效应T细胞/Treg细胞的比例，从而解除Treg细胞对效应T细胞的抑制[82]；紫锥菊能减少CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的数量，减弱其抑制作用，增强抗原呈递细胞的呈递功能，从而间接抑制Treg细胞的功能[83]。

综上，PD-1/PD-L1通路介导的肿瘤免疫逃逸已成为抗肿瘤临床研究的热点，本文对PD-1/PD-L1通路的研究进行了系统回顾，对PD-1/PD-L1通路研究历程中的一些关键结论及假说进行了总结。PD-1/PD-L1抑制剂已经取得了一定的疗效，但仍不够理想，且PD-1/PD-L1的免疫逃逸机制有待进一步深入研究，尤其是肿瘤微环境在其中发挥的作用。中药对肿瘤免疫调节具有很大的潜力，但其有效成分及具体作用机制尚未完全阐明，且目前对PD-1/PD-L1的研究十分匮乏，有必要进一步深入研究。

志谢：感谢项目指导单位中国中医科学院广安门医院的指导，感谢广州中医药大学第一附属医院相关工作人员的临床及基础性工作。