外周血循环肿瘤细胞与乳腺癌临床病理特征关系的研究

王建， 吕旭， 吴周姜丽， 张涛， 邵荣金

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)是外周血中具有高活力、高转移潜能的一类肿瘤细胞，它来自肿瘤的原发灶或转移灶[1]。这一概念早在1869年就已提出，近年来，CTC又成为肿瘤领域的研究热点。相关研究表明，CTC在诸多恶性肿瘤的临床诊断、疗效评估、预后监测等方面发挥十分重要的作用[2]。由于CTC在外周血中的数量极其稀少，对检测技术提出了极高要求。目前分离CTC方法包括免疫磁珠法、密度梯度离心法、双向电泳法、微孔滤膜过滤法及微流控芯片管理道法等[3]。本研究采用免疫磁珠富集技术结合荧光原位杂交法检测CTC，分析讨论外周血CTC的表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系，为乳腺癌病情判断提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 将2017年1月至2019年12月在宜兴市肿瘤医院治疗的129例乳腺癌患者纳入观察组，另外纳入63例良性乳腺病患者作为对照组。收集包括年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、病理类型、淋巴结转移情况、远处转移情况、TNM分期、雌激素(estrogen receptor，ER)和孕激素受体(progestogen receptor，PR)状态、人类表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor 2，Her2)状态及Ki-67表达状态。均为女性，乳腺癌组年龄28～74岁，中位年龄49岁；对照组年龄29～88岁，中位年龄53岁。纳入标准：①病理确诊为乳腺癌；②未接受全身化疗及其他抗肿瘤治疗；③无其他部位恶性肿瘤病史。排除标准：①炎性乳腺癌或乳腺癌处于急性炎症过程中；②哺乳期。本研究获得患者的书面知情同意，并获得本院伦理委员会批准。

1.2 CTC检测方法 抽取清晨空腹肘中静脉血3.2 ml，并用ACD抗凝剂抗凝，24 h内采用免疫磁微粒阴性富集法及荧光原位杂交技术检测CTC。具体过程：①免疫磁珠阴性富集法：在获取CTC检测标本后，基于室温条件下，24 h内完成磁珠富集，并涂片至标本框中干燥。②荧光原位杂交实验：应用醇类磷酸盐固定液对标本固定处理，放入已预热的生理盐水柠檬酸钠(SSC)缓冲液中静置10 min，促使细胞老化，梯度酒精中静置2 min脱水，室温晾干，添加10 μl探针，Rubber Cement封片，76 ℃变性5 min，37 ℃杂交1.5 h，43 ℃甲酰胺工作液洗片3次，每次5 min，室温下，在SSC中静置洗涤2次，每次5 min。③免疫荧光染色实验：用0.2%BSA溶液洗片2次，每次300 μl，配制成每人份20 μl CD45-AF594荧光抗体和180 μl 2%BSA溶液的抗体工作液，对标本在室温下并避光孵育1 h，再次洗片后取10 μl 4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)染液复染，盖片。

1.3 结果判读 不论单色探针还是双色探针，任一探针信号点>2个且无血源性白细胞表面抗原着色时，计为1个阳性细胞；当细胞有血源性白细胞表面抗原，或信号≤2个为阴性细胞。乳腺癌患者外周血中CTC≥1个/3.2 ml判为阳性，未检测到CTC判为阴性。

2 结果

2.1 CTC表达情况 乳腺癌组患者外周血CTC检出数明显高于对照组(P<0.001)，见图1。ROC曲线显示，CTC在乳腺癌组中的灵敏度为79.1%，特异性为93.7%，曲线下面积(AUC)为0.881，95%CI：0.834～0.929，P<0.005(见图2)。乳腺癌患者中CTC检测阳性患者102例，阳性率为79.1%，而对照组中CTC检测阳性为4例，阳性率为6.3%，两组差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

图1 CTC在肿瘤组和对照组检出的数目分布图

图2 CTC在肿瘤组检出数目的ROC曲线图

表1 乳腺癌和对照组患者的CTC表达水平 [例(%)]

2.2 CTC与乳腺癌临床病理特征的关系 按不同临床病理特征进一步分组的结果显示(见表2)，CTC检测阳性率的高低在乳腺癌不同病理类型、TNM分期及Her2表达状态中差异有统计学意义(P<0.05)，浸润性导管癌、Ⅲ～Ⅳ期、Her2阴性患者的CTC检测阳性率明显高于乳头状癌/小叶癌、Ⅰ～Ⅱ期、Her2阳性的患者；而在不同年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移、远处转移、ER状态、PR状态及Ki-67状态中差异无统计学意义(P>0.05)。多因素方差分析表明，CTC表达水平与年龄、病理类型及TNM分期有统计学意义(P<0.05)；Logistic回归分析表明，CTC表达水平与年龄、病理类型及Her2表达状态有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 CTC与乳腺癌患者的临床病理特征的关系 [例(%)]

表3 CTC与乳腺癌病理特征的多因素及Logistic回归分析

3 讨论

CTC作为液体活检的一种生物标志物已广泛应用于临床，是肿瘤转移过程中重要标志物[4]。既可以检测早期癌，也可以用于癌症晚期的治疗决策[5-6]。本研究发现，对照组检出4例CTC阳性，可能是有潜在恶性肿瘤或炎症反应，或是假阳性，假阳性出现不排除与检测的方式有关。不同的CTC检测方法在敏感度、特异性、假阳性率、假阴性率及操作性、形态学分析等方面各有优劣[7]。免疫磁珠富集技术的特异度最高，也是目前临床和科研应用最广的方法。本研究使用此方法检测患者周围血CTC，灵敏度及特异度分别为79.1%和93.7%，ROC曲线分析AUC为0.881。

本研究进一步对乳腺癌患者CTC检测水平与临床病理特征进行分析表明，CTC检测阳性率的高低在乳腺癌不同病理类型、TNM分期及Her2表达状态中差异有统计学意义(P<0.05)，而在不同年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移、远处转移、ER状态、PR状态及Ki-67状态中差异无统计学意义(P>0.05)。但是，把不同亚组的临床病理特征与CTC表达水平进行多因素分析，表明CTC阳性率与年龄、病理类型及临床分期有关。最后，我们进行Logistic回归分析，也显示CTC阳性率与年龄、病理类型及Her2表达阳性有关。综合以上分析，我们认为CTC表达水平与乳腺癌患者的年龄、病理类型、临床分期及Her2表达密切相关，而与肿瘤位置、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移、远处转移、ER状态、PR状态及Ki-67状态无关。高年龄组CTC检出率要低于低年龄组，表明低年龄组的乳腺癌患者出现转移的风险较大，这也证明了年龄是乳腺癌的复发和转移的重要因素[8]。浸润性导管癌为乳腺癌的常见类型，其侵袭性明显高于乳头状癌及小叶癌，易出现转移情况，这一现象也解释了我们得出的结果，CTC检测水平与病理类型有关[9]。此外，晚期乳腺癌患者外周血中CTC阳性率高于早期患者，CTC表达水平与TNM分期相关这一结果与有关文献报道一致[10-12]。

Her2是乳腺癌治疗的关键靶点，Her2表达与乳腺癌侵袭能力有关，是乳腺癌复发、转移的高危因素[13]。我们的研究结果提示，Her2阳性与CTC检测水平密切相关，这一结论与相关报道一致[14-15]。另外，有研究表明在Her2阴性乳腺癌患者体内检测出Her2阳性的CTC，认为CTC的Her2表型在细胞分裂过程是可变的。那么也可能出现Her2阳性的CTC可能分裂出Her2阴性的CTC，这也被认为是部分Her2阳性患者对靶向治疗效果不佳的一种机制[16-17]。由于与传统组织活检和CTC中Her2表达水平不一致性，可能实时监测CTC中Her2表达状态对靶向治疗的指导意义更大[18]。本研究未对CTC中Her2状态检测分析，暂不作分析，准备在接下来的研究中来阐明这一观点。

综上所述，免疫磁珠富集阴性技术联合荧光原位杂交法检测CTC具有较高诊断价值；外周血CTC表达水平可用于评估乳腺癌患者的病情，对判断预后有一定的价值。后期会随访患者的总生存及无进展生存时间，同时扩充样本量，对评估CTC与乳腺癌患者预后做进一步的研究。