玻利维亚进口盐中可培养嗜盐古菌组成分析

刘靖文，刘 柳，陈飞龙，陈绍兴

(安徽师范大学 生命科学学院，安徽 芜湖 241000)

1990年，Woese通过对生物的核糖体小亚基rRNA(原核生物16S rRNA、真核生物的18S rRNA)基因序列的分析提出三域学说，将生物界分为真核生物域、细菌域和古菌域三大域，并正式提出古菌(Archaea)的概念[1]。早期发现的古菌通常生活在极端环境中，地球最古老的生命可能是这些极端微生物，因此研究极端微生物对认识生命的起源及进化机制具有重要意义。嗜盐古菌是极端微生物的一大类群，广泛存在于盐矿、盐湖、海洋以及盐腌制品表面等高盐环境[2-4]。它们经过长期进化，形成了独特的细胞结构和生理代谢系统，这在环境治理、食品开发、工业和农业生产等领域有着重要的应用价值[5-8]。

玻利维亚安第斯山脉地区分布有众多的高盐环境，如盐矿，其中卤水型矿床形成于封闭汇水盆地内，而后又由火山运动及气候条件的影响产生大量岩脉和矿脉，可能以盐湖的形式露出地表[9]。玻利维亚位于南美洲内陆中西部，地形以高原为主，分布有大量盐湖[10]。2017年，Haferburg等采用基于16S rRNA基因V3-V4区的Illumina MiSeq技术对世界最大盐湖、玻利维亚乌尤尼盐湖，进行群落结构分析，首次揭示了该盐湖存在丰富的微生物群落结构组成[11]。2019年，Pérez-Fernández等研究乌尤尼盐湖嗜盐微生物群落分布与地理位置的关系，不仅发现在盐滩上分布有Haloarcula、Halorubrum、Halorhabdus和Halolamina等嗜盐古菌，还有Salinibacter和Halorhodospira等嗜盐细菌，以及还存在未分类的Gammaproteobacteria成员，还发现嗜盐古菌群落在盐滩上的分布是均匀的，而嗜盐细菌菌落则随地理位置的差异表现出局部变异的分布规律[12]。

之前的研究主要集中在采用免培养技术对玻利维亚盐湖中嗜盐微生物的群落组成及多样性进行研究。尽管免培养技术具有很多优势，但也存在如核酸提取、引物和探针的设计等方面的问题，并且不能揭示那些崭新的未知物种，也不能获得具有开发利用前景的微生物菌株资源[13]。

因此本研究采用纯培养方法对玻利维亚进口商品盐样品的嗜盐微生物进行分离培养，通过16S rRNA基因的测序和序列相似性分析，确定所分离菌株的分类地位。在此基础上，对该样品中的嗜盐微生物群落组成和物种多样性进行系统研究，并且选取部分代表菌株进行胞外酶活及拮抗作用测定。这不仅使我们对玻利维亚盐样品中可培养嗜盐微生物群落组成及物种多样性有所了解，而且获得了一批胞外酶活性较高或产抑菌活性物质的具有开发利用潜力的菌株资源。

1 材料和方法

1.1 样品来源

袋装玻利维亚商品盐(280克包装)，由辰马国际有限公司生产，品名为“印帝欧玫瑰盐-细粉状”，原产地为玻利维亚安第斯山。样品呈肉粉色，为岩盐(图1)。

图1 玻利维亚商品盐Figure 1 The commercial salt imported from Bolivia注：a袋装商品盐；b商品盐样品形态

1.2 培养基的配制

本研究采用嗜盐古菌常用的AS-168培养基，该培养基的成分和含量为(每升)：NaCl 200g、MgSO4·7H2O 20g、KCl 2g、柠檬酸钠3g、谷氨酸单钠1.8g、FeSO4·4H2O 50mg、MnCl2·4H2O 0.36mg、酸水解酪蛋白5.0g、酵母粉5.0g，用蒸馏水补足1升[14]。

为了研究不同pH条件下嗜盐微生物的群落组成，将AS-168培养基的pH用1M的NaOH分别调至7.5、8.0、8.5、9.0和9.5。固体平板的配制：以1.5%(w/v)的比例加入琼脂粉，1×105Pa，20min，灭菌，倒平板(～25mL/皿)[15]。

1.3 主要试剂和仪器

NaCl、MgSO4·7H2O，国药集团化学试剂有限公司；酸水解酪蛋白氨基酸、酵母粉，Oxoid公司；PCRMix，北京博迈德基因技术有限公司。

恒温培养箱、恒温震荡培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；PCR仪，北京东胜创新生物科技有限公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；凝胶成像系统，上海天能公司；台式高速离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；高压蒸汽灭菌锅，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。

1.4 商品盐样品溶解及微生物复苏培养

将10g商品盐样品溶解到100mL已灭菌的10%(w/v)NaCl溶液中。取500μL均匀涂抹于不同pH的固体AS-168平板上。将每个平板用保鲜膜封口，置于37℃，培养3-4周。

待菌落形成后，用灭菌牙签将所形成的单菌落，通过平板划线，转移到相应pH值的新鲜固体平板上。经连续3-4次平板划线，获得各个菌株的纯培养物，并对所分离的菌株进行编号。

1.5 16S rRNA基因序列测定

1.5.1 DNA模板制备 对于纯水裂解型的菌株，挑取少量菌株纯培养物菌苔，重悬于50-100μL蒸馏水中。该细胞裂解液即可作为纯水裂解型菌株16S rRNA基因扩增的模板。

对于纯水不裂解型的菌株，则同样挑取少量菌苔，重悬于50-100μL蒸馏水中，用等体积的酚氯仿溶液(苯酚:氯仿=1:1;v/v)抽提(12,000r/min离心5min)收集的上清液再用氯仿抽提(12,000r/min离心5min)，收集的上清液即为总DNA模板。

1.5.2 16S rRNA基因的PCR扩增 以上述制备的总DNA为PCR扩增模板，选用F8(5’-TTGATCCTGCCGG

AGGCCATTG-3’)和R1462(5’-ATCCAGCCGCAGATTCCCCTAC-3’)为引物，配制PCR扩增体系[16]。PCR扩增体系(50.0μL)包括25.0μL 2×PCR mix(擎科生物北京)、2.0μL总DNA模板(20ng/μL)、2.5μL引物F8(10μmol/L)、2.5μL引物R1462(10μmol/L)、18.0μL dd H2O。PCR扩增反应：94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1.5min，35个循环；接着72℃体外延伸7min[17]。

扩增结束后，取5.0μL的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测成功的剩余PCR产物送生物公司(擎科生物昆明分部)，使用引物R1462进行DNA测序。

1.6 物种分类地位确定

从测序公司获得测序原始峰图，用BioEdit进行初步分析[18]，截取可信度较高的中间区域，导入GenBank或EzBioCloud数据库[19]，与已发表种的16S rRNA基因序列进行相似度比对分析。以≤98.5%的16S rRNA基因序列相似性作为属于相同种标准[20]，确定所分离菌株的分类地位。

1.7 物种多样性分析

根据上述所确定的菌株分类地位，对本研究分离的所有菌株进行物种多样性分析。计算商品盐样品总体和不同pH条件下的物种多样性，如香农-威纳指数、辛普森指数、玛格列夫丰富度指数、皮洛均匀度指数和贝格-派克优势度指数[21]。

1.8 胞外酶活检测

从所分离的嗜盐古菌每个物种中选1-2个代表菌株进行胞外酶活测定。

(1)氧化酶活性：将新鲜菌苔涂抹于用1%的对氨基二苯胺盐酸盐水溶液和1%的α-萘胺溶液的混合溶液浸润的滤纸上。在10s内菌苔出现蓝色为阳性，10-60s内出现蓝色为延迟反应，60s内未出现蓝色为阴性反应[22]。

(2)触酶活性：用5%的H2O2溶液覆盖新鲜菌苔，有气泡产生为阳性反应，反之为阴性反应[22]。

(3)淀粉酶活性：将菌株划线在含有1%(w/v)的可溶性淀粉的AS-168固体平板上，待菌落形成后，用碘液覆盖平板，观察菌落周围有无透明圈。若菌落周围有透明圈说明胞外淀粉酶阳性。

(4)明胶酶活性：将菌株划线于含1%(w/v)明胶的AS-168固体平板上，待菌落形成后，用Frazier试剂检测明胶液化情况。若菌落周围有透明圈说明胞外明胶酶阳性[23]。

(5)蛋白酶活性：将菌株划线于含1%(w/v)脱脂奶粉的AS-168固体平板上，待菌落形成后，观察菌落周围是否有蛋白水解圈。若菌落周围有透明水解圈说明胞外蛋白酶阳性[23]。

1.9 拮抗作用测定

为了测定分离菌株的拮抗作用，我们选取pH值7.5条件下能正常生长的菌株为待测菌株，以实验室保藏的另4株嗜盐古菌：Haloferaxsp.Q22、Halorubrumsp.LN72、HaloarculahispanicaATCC 33960和Halorubrumsp.F4等，作为拮抗作用的指示菌(见表1)。

表1 拮抗作用指示菌

将Q22、LN72、ATCC 33960和F4等4株指示菌分别接种于pH为7.5的AS-168液体培养基中，37℃，180r/min培养，待菌悬液OD600接近1.0时，将10mL各上述菌株菌悬液加入100mL(～55℃)固体培养基中。混匀后倒平板，制作4种指示菌平板。

将选出的在相同pH值(pH7.5)能正常生长的20个代表菌株，分别在上述4种指示菌平板上划线，37℃培养箱中倒置培养10天，观察抑菌圈。

2 结果

2.1 物种组成总体分析

利用不同pH值的AS-168培养基从玻利维亚商品盐样品中共分离到505株嗜盐微生物，以16S rRNA基因测序及序列相似性比对分析，确定所分离菌株的分类地位。这505株嗜盐微生物全部属于嗜盐古菌，菌株分布于Natrialbales、Haloferacales和Halobacteriales等3个目，Natrialbaceae、Halorubraceae、Haloferacaceae、Halococcaceae、Halobacteriaceae和Haloarculaceae等6个科，Natronococcus、Natrinema、Natrialba、Halovivax、Haloterrigena、Halorubrum、Halopenitus、Halobellus、Halococcus、Halobacterium、Halalkalicoccus、Haloarcula和Halosimplex等13个属(表2)。目前嗜盐古菌现有的3个目和6个科本研究所分离的菌株均有分布(表2)。

来自于Halobacterium属的菌株最为丰富，共有180株，占所有菌株数量的35.6%。菌株数量排在前5的属分别是Halobacterium、Halococcus、Haloarcula、Halopenitus和Halorubrum，这5个属的菌属数量占所有菌株数量的90.5%(表2)。目前报道的Halobacterium属有6个物种，而本研究揭示的Halobacterium属菌株全部属于一个物种，即Halobacteriumnoricense。

表2 玻利维亚商品盐可培养嗜盐古菌群落组成情况

此外，Halorubrum属共分离到50个菌株，分别来自于10个物种，Haloarcula属共分离到70个菌株，分别来自于9个物种。这是本研究揭示的物种数最丰富的2个属。

2.2 不同pH培养条件下可培养嗜盐古菌比较

2.2.1 不同pH条件下物种组成 从pH7.5的培养基中分离到188株嗜盐古菌，分别属于Halobacterium、Halococcus、Haloarcula、Halalkalicoccus、Halopenitus、Halorubrum、Natrinema和Natrialba等8个属；从pH8.0的培养基中共分离到195株嗜盐古菌，分别属于Halobacterium、Halococcus、Haloarcula、Halosimplex、Halopenitus、Halorubrum、Halobellus、Natrinema、Haloterrigena和Halovivax等10个属；从pH8.5的培养基中共分离到51株嗜盐古菌，分别属于Halobacterium、Halococcus、Haloarcula、Halopenitus和Halorubrum等5个属；从pH9.0的培养基中共分离到62株嗜盐古菌，分别属于Halobacterium、Halococcus、Haloarcula、Halopenitus、Halorubrum、Natrialba和Natronococcus等7个属；从pH9.5的培养基中共分离到9株嗜盐古菌，分别属于Halorubrum、Natrialba和Natronococcus等3个属(表2)。

从获得的菌株数量看，从pH8.0的培养基中分离到的菌株最多，为195株，而从pH9.5中分离到的菌株最少，为9株。在pH8.0条件下，平均每分离19.5株获得一个不同属，而在pH9.5的条件下，平均3株一个属。说明在pH9.5条件下，获得不同属菌株的概率更高，更容易分离到不同属的菌株(表2)。

我们将pH7.5作为较低pH；将pH8.0作为中度pH；将pH8.5作为较高pH；将pH9.0和pH9.5归为高pH。通过共有和特有分类单元比较分析，发现上述4种pH条件都分离到Halobacterium、Halococcus、Haloarcula、Halopenitus和Halorubrum属菌株，说明这5个属的菌株能适应较广泛的pH范围。在pH8.0的条件下，特有属的数量最多；pH值低于或高于8.0时，特有属数量均显著减少(图2)。

图2 不同pH条件下共有和特有属数量和占比分析Fig.2 Common and unique genera of different pH media

2.2.2 不同pH培养条件下优势种分析 从玻利维亚商品盐样品所分离到的505株可培养嗜盐古菌中有281株来自Halobacteriaceae科。其中来自Halobacterium属的菌株数量最多，有180株，占总分离数的35.6%，是该生境的绝对优势物种，这可能也是使盐样品呈粉红色的最主要原因。其次是来自Halococcus属菌株，有101株，占20.0%，这是该生境的次优势类群(表2)。

各属级水平的组成情况如图3所示，在不同pH条件下从玻利维亚商品盐样品中分离得到的优势物种不尽相同。在pH为7.5和8.5的培养基分离的嗜盐古菌中，分别有107株、30株来自Halobacterium属，分别占所分离菌株的56.9%、58.8%，说明Halobacterium属菌株为该pH生境中的优势物种(图3)。在pH为9.5的条件下共分离到9株嗜盐古菌，其中有7株来自Natrialba属，占比77.8%，说明Natrialba属菌株为嗜盐嗜碱类群，也成为较高pH条件下的优势物种(图3)。而在pH为8.0和9.0的培养基中，嗜盐古菌种类分布较均匀，优势种的优势地位并不明显：在pH8.0条件下Halobacterium属菌株最多，有42株，占比21.5%；在pH9.0条件下Halopenitus属菌株最多，有22株，占比35.5%(图3)。

图3 玻利维亚商品盐可培养嗜盐古菌组成(属级水平)Fig.3 Composition of cultivable halophilic archaea from commercial salt of Bolivia (genus level)注：不同颜色代表不同属嗜盐古菌，色块高度代表该属占比。

2.3 不同pH培养基分离的嗜盐古菌多样性分析

对从不同pH培养条件下分离到的嗜盐古菌进行多样性分析(表3)。在pH8.0条件下，可培养嗜盐古菌的香农-威纳指数最高，为2.8；pH9.0其次，为2.4。在pH8.0和pH9.0条件下，辛普森指数最高，为0.9。在pH8.0条件下的玛格列夫丰富度指数最高，为5.9；pH9.0其次，为4.1。指数越高，物种多样性越高。

表3 可培养嗜盐古菌的多样性分析

在pH9.5条件下，皮洛均匀度指数最高，为0.8；pH9.0其次，为0.6。指数越高均匀度越高，相同物种数的条件下多样性指数越高。在pH8.0条件下，贝格-派克优势度指数最低，为0.2；pH9.0和pH9.5其次，为0.3。指数越高，优势物种的优势地位越明显。

通过上述五种多样性指数分析，可以得出，在pH为8.0和9.0培养条件下物种多样性较高。具体体现在物种数量丰富，优势种在群落中地位不明显，物种个体数目较为均匀。

2.4 胞外酶活特征

从上述可培养嗜盐古菌每个物种中选取1株生长较快的代表，共选取39株菌，进行了胞外酶活测定。结果发现2株具有蛋白酶活性，均为Natrialba属菌株；5株具有明胶酶活性，分别来自于Halococcus、Halovivax和Natrialba属菌株；6株具有淀粉酶活性，分别属于Natrialba、Haloterrigena、Halococcus、Haloterrigena和Halalkalicoccus属(表4)。大多数菌株具有氧化酶和触酶活性(表4)。其中属于Natrialba属的J-8、J-9菌株具有淀粉酶、明胶酶、蛋白酶等多种胞外酶活性，具有较大的开发利用前景。

表4 胞外酶活测定

2.5 部分菌株的拮抗作用

从所选取的20株嗜盐古菌对Q22、LN72、ATCC 33960和F4等4株菌的拮抗作用结果看，来自于Haloterrigena属的菌株J-68对上述4个指示菌均具有明显的拮抗作用(表5)。这为探索发现嗜盐古菌来源新型抑菌活性物质提供材料。

表5 拮抗作用

3 讨论

玻利维亚安第斯山脉附近分布有众多的高盐环境，其中卤水型矿床形成于封闭汇水盆地内，多以盐湖的形式露出于地表[10，24]。获得纯培养物不仅可以了解嗜盐古菌在盐湖生态中的分布，也是开发利用微生物资源的前提[25]。本研究从玻利维亚进口商品盐样品中共分离到505株嗜盐古菌，并结合16S rRNA基因的测序和序列相似性分析发现，这些菌株分布于嗜盐古菌现有的所有3个目6个科。

尽管我们采用纯培养的方法发现了大量的嗜盐古菌物种，但Haferburg等[11]和Pérez-Fernández等[12]通过高通量测序所揭示的相关研究中Halonotius和Halohabdus等属物种在本研究中并未发现。可能与Halonotius和Halohabdus属菌株主要生活于中性pH条件有直接关系[26-27]。目前对嗜盐古菌培养条件的探索尚未成熟，本研究所采用pH7.5-9.5的人工筛选条件不利于这两个属物种的生存。

从目前分离的505株嗜盐古菌来看，13个属、39个种，丰富度指数为6.1，Simpson指数为0.8，Shannon指数为2.5，表明玻利维亚盐矿中具有较为丰富的微生物资源。此外，贝格-派克优势度指数为0.4，相比而言，青海湖、察尔汗盐湖和新疆艾比湖的可培养嗜盐古菌群落优势度指数分别为0.3、0.2、0.3[21,25,28]。说明本研究所揭示的优势种在群落中的优势地位较高，说明在漫长的地质变化中该物种已经对玻利维亚独特的盐矿环境产生了高度适应，占据了有利的生态位，从而成为优势种。高通量测序和本研究的纯培养方法均表明玻利维亚盐湖生态中Halobacterium属菌株占据优势地位，为明显的优势类群[11-12]。此外，通过对比优势物种的16S rRNA基因序列分析，发现不同菌株间存在一定程度的序列差异变异，这意味着玻利维亚盐矿中的微生物群落演替还处于活跃状态，在接下来的发展中种群结构和分布可能会发生一定变化。综合来看，玻利维亚盐矿中可培养嗜盐古菌数量较高、物种数较多但均匀度不高，群落结构发育还未进行到稳定状态。

许多嗜盐古菌在生长过程中会分泌一些胞外蛋白，如胞外酶和嗜盐菌素。嗜盐菌素是一种蛋白类抗生素，能抑制其他邻近嗜盐古菌的生长[29]。胞外酶分泌到周围环境中，有分解有机大分子的能力，从而有利于它们在贫瘠的盐矿中长期生存[30-31]。本研究从玻利维亚商品盐样品可培养嗜盐古菌中筛选到1株具有产嗜盐菌素活性的菌株。嗜盐古菌所产胞外酶(如胞外蛋白酶、淀粉酶和明胶酶)能在高盐环境中发挥功能，因此它们在腌制食品、缩短鱼露发酵周期和皮革的保存等方面均发挥着重要作用[32-33]。本研究筛选到若干产胞外酶活菌株，可为积累宝贵的嗜盐微生物菌种资源和极端环境微生物资源的深入开发利用奠定基础。