苹果渣饲料中展青霉素生物脱除的条件优化及脱除前后饲料中营养物质评价

杨 阳，邹 东，纪 剑，王海鸣，张银志，朱 璇 ，孙秀兰,

(1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.江南大学食品学院，江苏无锡 214122；3.广州广电计量检测股份有限公司，广东广州 510000)

展青霉素(Patulin，PAT)又称棒曲霉毒素，分子式C7H6O4(如图1)，是一种有毒的真菌次级代谢产物[1]，对人和动物有多种毒性[2-3]。研究表明展青霉素对大鼠和小鼠具有致癌、致畸、免疫毒性、基因毒性和神经毒性等作用，可导致肝脏，脾脏和肾脏等损伤，严重威胁人和动物的健康[4-7]。鉴于展青霉素的毒性危害，世界上多个国家都制定了限定标准，我国规定苹果汁和苹果制品中展青霉素的最高含量不得超过50 μg/kg[8]；欧盟限定果汁产品中展青霉素的含量最高不得超过50 μg/kg，固体水果产品中最高不得超过25 μg/kg，儿童和婴儿食品中不得超过10 μg/kg[9]；世界卫生组织建议，人类每天摄入的展青霉素量不应超过0.4 μg/kg[10]。因此，研究展青霉素的脱毒十分有必要。目前，展青霉素的脱毒方法主要为物理[11-12]、化学[13]和生物方法[14]。物理方法主要采用对原料的挑选清洗、微波处理和吸附杂质等方式[15]，该方法需要耗费大量的人力物力，成本较高，且容易造成原料中营养成分损失；化学方法主要为使用添加剂或化学杀菌剂等手段降低展青霉素的含量[16]，但该方法会破坏产品的品质，造成农药残留等二次污染问题；生物发酵法与这些方法相比具有经济、高效等特点，越来越吸引研究者的关注[17-18]。

图1 展青霉素的化学结构图Fig.1 Chemical structure diagram of patulin

我国是世界最大的苹果生产国，2018年苹果总产量达到3923.34 吨[19]。近年来随着苹果产量的增加，我国苹果浓缩汁加工业也得到了迅速的发展，在苹果汁的生产过程中会产生大量的苹果渣，每年我国有超过300万吨苹果渣产生[20]，这些苹果渣处理不当，不仅会造成资源浪费，还会造成环境污染。苹果渣中纤维素含量较高而蛋白质含量较低，若将其直接作为动物饲料，容易带来动物的营养不良、腹泻等问题[21-22]。苹果渣含有较高的水分，极易被微生物侵染。扩展青霉是苹果及其制品的主要污染微生物，其污染会产生大量展青霉素[23]。目前我国并未对饲料原料中的展青霉素做出明确的限量标准，大多养殖场在使用苹果渣做为饲料时并未对其真菌毒素进行检测，这为苹果渣的资源化应用带来了很大的风险。

目前，利用微生物发酵苹果渣的研究在国内外已有一些报道[24]，大多数研究是为了改善苹果渣中的蛋白质含量，使其更适用于动物饲料[25]。关于微生物发酵法脱除苹果渣中展青霉素污染的研究未见报道。发酵菌株黑曲霉FS10是本课题组从发酵酱油醅中筛选而得[26]，已被证明是食品级安全菌株，在过去的研究中该菌株显示出对多种真菌毒素优异的降解能力[27-28]。本研究使用黑曲霉FS10菌株生物发酵展青霉素污染的苹果渣，采用响应面法对比不同条件下发酵前后展青霉素的降解率变化，筛选出最优的发酵参数，并对最佳发酵参数下苹果渣中营养物质进行评价。该研究目的旨在为苹果渣资源化利用的提供新思路，并为研发一种安全富有营养的苹果渣饲料提供有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株 本课题筛选并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M2013703；展青霉素污染的苹果渣(烘干) 随机采购于江苏省十家养殖场，经检测所采购样品均存在较高的展青霉素污染(2.61～11.37 mg/kg)，选取污染最严重的样品进行后续实验；展青霉素标准品 纯度≥98%，美国GLPBIO公司；乙腈、乙酸乙酯 色谱纯，上海国药集团化学试剂有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基) 上海博微生物科技有限公司。

Agilent 1260 HPLC 系统 美国安捷伦公司；VB-40立式高温高压灭菌锅 德国SYSTEC；BSC-1300超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；SHP-150生化培养箱 上海森信实验仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱、SX2-5-12N马弗炉 上海一恒科学仪器有限公司；K9840自动凯氏定氮仪、SOX406脂肪测定仪 山东海能科学仪器有限公司；THZ-D台式恒温振荡器 上海百典仪器设备有限公司；EX-OHOUS电子天平、旋涡振荡仪 美国奥豪斯公司；Scientz-10N台式冷冻干燥机、Scientz-10LS真空离心浓缩仪、SB-5200DT超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；Eppendorf离心机 德国艾本德公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑曲霉FS10菌株活化及孢子悬浮液制备 将黑曲霉FS10接种于PDA固体培养基28 ºC培养5 d后用含0.05%吐温-80的无菌生理盐水将孢子洗下，调整孢子浓度为106CFU/mL，作为FS10孢子悬液备用。

1.2.2 苹果渣生物发酵处理 将苹果渣粉碎，过30目筛后混合均匀收集苹果渣备用。利用GB/T 14699.1-2005的采样方法对粉碎后苹果渣进行采样称重后分装于50 mL三角锥形瓶中，使用封口膜封口，进行121 ℃、20 min灭菌处理。

将灭菌处理过的苹果转移至发酵容器中，加入无菌水至一定料水比(苹果渣质量与无菌水体积的比值，g/mL)，加入FS10孢子悬浮液至一定接种量(菌液体积与苹果渣质量的百分比)，搅拌均匀后于一定温度下进行恒温有氧发酵，分别在发酵后一定时间取样。

1.2.3 苹果渣中展青霉素及营养指标含量的测定 参考GB5009.185-2016对苹果渣中展青霉素进行提取和浓度测定；参考GB/T 6432-2018对苹果渣中粗蛋白进行检测；参考GB/T 6434-2006对苹果渣中粗纤维素进行检测；参考GB/T 6433-2006对苹果渣中粗脂肪进行检测；参考GB/T 18246-2019对苹果渣中氨基酸进行检测；参考GB/T 6438-2007对苹果渣中灰分物质进行测定。

1.2.4 单因素实验设计 以展青霉素脱除率为指标，控制孢子悬浮液浓度为106CFU/mL，分别对接种量1%、5%、10%、15%、20%，料水比 1∶3(g/mL)，培养温度30 ºC，发酵时间3 d；发酵温度20、25、30、35、40 ºC，料水比 1∶3，接种量 10 %，发酵时间3 d；发酵时间1、2、3、4、5 d，料水比1∶3(g/mL)，接种量10%，培养温度30 ºC；料水比1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5、1∶4 g/mL，接种量10%，培养温度30 ℃，发酵时间4 d。分别对4个因素进行单因素实验，确定各因素对展青霉素降解效率的影响。

展青霉素降解率计算方法为：展青霉素降解率(%)=(未发酵样品中展青霉素含量 - 发酵后样品中展青霉素含量)/未发酵样品中展青霉素含量 × 100

1.2.5 响应面法因素水平设计 根据单因素实验结果，利用Design Expert11软件应用Box-Behnken设计方法，选择接种量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)、料水比(D)作为响应变量，以展青霉素降解率作为响应值进行响应面优化设计，试验因素及水平见表1。

表1 响应面试验因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3 数据统计分析

所有实验均重复3次，采用SPSS 26、GraphPad Prism 8、Design Expert 11软件对数据进行处理分析及图像绘制。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 接种量对展青霉素脱除的影响 不同接种量对于黑曲霉脱除苹果渣中的展青霉素有着重要影响，接种量过小或过大均不利于发酵的进行。图2表示不同接种量对展青霉素降解率的影响，在接种量为10%时，展青霉素的降解率最高，在接种量为1%～10%时展青霉素降解率随着接种量增加而升高，接种量为15%时，展青霉素降解率明显下降，这可能是发酵体系中的营养物质有限，接种量过大造成微生物之间生存竞争加大，从而导致微生物的生长受到抑制，所以选择10%的接种量最为适宜。

图2 接种量对黑曲霉脱除展青霉素的影响Fig.2 Effect of inoculation amount on the removal of patulin by Aspergillus niger

2.1.2 发酵温度对展青霉素脱除的影响 不同发酵温度会对发酵微生物生理活性产生极大的影响，且对同一发酵微生物而言，菌最适生长温度与最适发酵的温度并不一定相同，故需要对黑曲霉降解苹果渣中展青霉素的最适发酵温度进行探究。由图3可知，随着发酵温度的升高，苹果渣中展青霉素的降解速率呈现先升高后降低的趋势。当温度为30 ℃时展青霉素降解率达到最高，当温度达到40 ℃时，降解率迅速降低。这可能是由于每种微生物都有比较适合生长和发酵的温度，温度过低微生物的生长繁殖变慢，而温度过高会导致微生物内的酶活降低，影响其正常的生长，因此选择30 ℃的发酵温度最为适宜。

图3 发酵温度对黑曲霉脱除展青霉素的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on the removal of patulin by Aspergillus niger

2.1.3 发酵时间对展青霉素脱除的影响 发酵时间是发酵过程中的重要参数之一，由图4可得，展青霉素降解率随时间的延长而升高，在发酵时间为3～5 d后基本保持稳定。参考刘倩男[29]研究，发酵苹果渣多用于动物饲料使用，需要发酵过程丰富其中蛋白含量，且发酵时间过长黑曲霉会产生大量的黑色菌丝，影响发酵物的感官品质。因此本研究选择发酵时间4 d为最佳发酵时间。

图4 发酵时间对黑曲霉脱除展青霉素的影响Fig.4 Effect of fermentation time on the removal of patulin by Aspergillus niger

2.1.4 料水比对展青霉素脱除的影响 发酵体系中的水分含量在微生物发酵过程中起着至关重要的作用，如图5可知，随着料水比的增大，苹果渣中展青霉素的降解率呈先升高后稳定的趋势，水分含量较低时微生物的活性较弱，随着水分含量的增加微生物的生理活性也随之增加，当水分含量满足微生物需求时，其对微生物的生长影响不大。当料水比为1∶3时展青霉素降解率达到最大值，故选取1∶3作为苹果渣中展青霉素的最适发酵料水比。

图5 料水比对黑曲霉脱除展青霉素的影响Fig.5 Effect of ratio of material to water on the removal of patulin by Aspergillus niger

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计因素与水平 为了得到黑曲霉发酵脱除苹果渣中展青霉素的最适参数，根据上述单因素实验得到的较优发酵参数，采用响应面法对接种量、料水比、发酵时间、发酵温度四个因素两两交互影响进行响应面试验设计。通过单因素实验确定黑曲霉生物发酵脱除苹果渣中展青霉素的四个单因素参数适宜范围，选取展青霉素降解率为考察指标进行响应面优化。结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface test design and results

2.2.2 响应面回归模型的建立与分析 通过Design Expert 11对实验结果进行回归拟合及方差分析，得到以展青霉素降解率(Y)为响应值，接种量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)、料水比(D)的二次多项回归模型：

为检验回归模型的有效性，对回归模型进行方差和显著性分析，见表3。

结果表明，回归模型极显著(P<0.001)，失拟项不显著(P>0.05)，R2adj为0.8459，表明该模型有较好的拟合性，该回归模型可用于预测分析且能较好地反映各因素与响应值之间的关系。由表3可知，苹果渣中展青霉素降解率的影响因素主次顺序为发酵温度>料水比>发酵时间>接种量。

表3 展青霉素降解率回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of patulin degradation rate regression model

2.2.3 各因素两两交互作用 如图6所示，影响黑曲霉发酵苹果渣的4个因素(接种量、发酵温度、发酵时间和料水比)两两因素交互作用的响应面图，结合表3结果，交互项AB、AC、AD、BC、BD、CD对试验结果的显著性分析均为P>0.05，表明接种量、发酵温度、发酵时间和料水比这4 个因素的两两交互作用不显著。上述回归模型的最佳值存在响应面最高点，等高线图的圆心，即展青霉素降解率最大时的稳定点，与之对应的因素水平即为最佳工艺条件[30]。

2.2.4 响应面最优条件的确定 运用Design Expert 11 软件分析得最优脱除展青霉素的参数为接种量9.54%，发酵温度31.25 ºC，发酵时间3.91 d，料水比1∶3.24。此条件下预测的展青霉素降解率为98.33%。鉴于实际实验操作的可行性，选取接种量10%，发酵温度31 ºC，发酵时间4 d，料水比1∶3.2，在此条件下进行黑曲霉生物发酵苹果渣实验，设置3个平行，得到展青霉素均降解至检出限以下(6 μg/kg)，降解率为100%，与理论值相对误差为1.67%，说明该优化参数可行，具有实际应用价值。

2.3 最优发酵参数下苹果渣中营养物质评价

在展青霉素降解的最佳条件下，对发酵前后苹果渣中粗蛋白、粗脂肪等营养物质进行研究。以干物质为基础，与发酵前苹果渣相比，发酵后的苹果渣中粗纤维含量从20.26%降低17.32%；粗蛋白含量从 8.16% 提高至 10.08%；粗脂肪含量从3.32%提高至4.06%；粗灰分从3.34%提高至4.76%；总氨基酸含量从发酵前的64.43 mg/g提高至73.78 mg/g(表4、表5)。表明黑曲霉FS10可以利用苹果渣中残余的营养物质，降解苹果渣中的纤维素并合成蛋白质，同时氨基酸含量也显著提高。氨基酸能够增强动物的免疫力，增进动物食欲，促进动物生长发育等作用。该方法不仅能对污染苹果渣进行解毒脱毒，还能获得微生物发酵过程中的氨基酸、蛋白质等中间代谢产物，符合发酵饲料的菌种筛选条件[31]，为污染苹果渣的资源化利用提供了新的思路。

3 结论

本研究利用黑曲霉FS10生物发酵苹果渣，研究了接种量、料水比、发酵时间、发酵温度四个因素对苹果渣中展青霉素降解效果的影响，运用响应面法优化上述四个条件对展青霉素的降解效果，研究结果表明在接种量10%，发酵温度31 ºC，发酵时间4 d，料水比1∶3.2的条件下进行黑曲霉生物发酵展青霉素污染的苹果渣，通过对发酵条件的优化发现该黑曲霉菌株对展青霉素的脱除有着明显的效果，可将其降解至检出限以下(6 μg/kg)，即发酵后苹果渣中的展青霉素完全被降解。

有研究表明黑曲霉发酵可用于开发苹果渣蛋白饲料，减少动物直接使用苹果渣饲料时造成的营养不良[29]。本研究对展青霉素降解最优条件下发酵后苹果渣的基本物质进行测定。结果表明，发酵后的苹果渣中粗纤维含量从20.26%降低17.32%；粗蛋白含量从 8.16% 提高至 10.08%；粗脂肪含量从3.32%提高至4.06%；粗灰分从3.34%提高至4.76%；总氨基酸含量从发酵前的64.43 mg/g提高至73.78 mg/g。因此，黑曲霉FS10发酵展青霉素污染的苹果渣，不仅能完全脱除苹果渣中的展青霉素，还能改善苹果渣为原料的饲料中蛋白质、氨基酸等营养物质含量较低的问题，并为安全、富有营养的苹果渣饲料加工提供了有力的技术参考。此外，进一步优化发酵条件，更好地提高发酵后苹果渣中蛋白质、氨基酸等营养物质的含量，以及探究发酵苹果渣饲料对动物生长发育的影响将是今后研究的重点。

图6 各因素交互作用对展青霉素降解率影响的响应面图Fig.6 Response surface plots of the interaction of various factors on the removal rate of patulin

表4 黑曲霉固态后发酵苹果渣基本成分的变化(干物质基础)Table 4 Effect of Aspergillus niger fermentation on nutrients composition of apple pomace( DM basis)

表5 黑曲霉固态发酵苹果渣后氨基酸成分的变化(干物质)Table 5 Effect of Aspergillus niger fermentation on amino acid composition of apple pomace (DM basis)