摩洛哥发酵橄榄汁中乳酸菌的分离鉴定及其多样性研究

刘文俊，韩 菲，史 迪，刘 琛，柳 青，郭 琳，李 瑜

(内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室, 农业农村部奶制品加工重点实验室，内蒙古自治区乳品生物技术与工程重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018)

橄榄又名青榄、青果，是一种常绿乔木树种且具有很强的生长能力，橄榄果风味独特，富含多种活性物质，且极具地域特色，对于改善肠道菌群、养肤护肤以及预防慢性病等方面有着良好的作用[1]。近些年人们开始深入研究橄榄的精加工制品，目前存在的主要产品有果脯蜜饯、橄榄汁、橄榄油等[2]。其中，新型饮料橄榄汁不仅有独特的口感，而且还具有保肝、醒酒、护喉等功效[3]，深受消费者的喜爱。

众所周知摩洛哥有橄榄之乡的美称，由于摩洛哥地区降水量少，光照充足，所以十分利于橄榄生长。独特的地域、气候孕育了独特的植物、动物和微生物，发酵橄榄汁这一具有独特地域特色的食品必然有其特有的乳酸菌菌群结构，然而关于发酵橄榄汁中乳酸菌多样性的研究还未见报道。

传统植物性发酵食品中孕藏着丰富的乳酸菌资源，其中常见的乳球菌属中的Lactococcus lactis、乳杆菌属中的Lactobacillus plantarum在植物性发酵食品和发酵饮料中常常被分离到，并且应用广泛。例如：任沛东等[4]在自然发酵苦菜中筛选并鉴定出5株高产酸、益生特性较好的植物乳杆菌，可广泛应用于食品行业的生产；朱珺等[5]筛选出植物乳杆菌581具有润肠通便功能和良好的发酵特性，可用于具有益生功能的果蔬发酵饮料的开发。在食品行业中乳酸乳球菌由于益生特性较好且可以产生无毒的食品防腐剂乳链菌肽而被广泛应用[6]，在食品行业前景广阔。因此，从自然发酵食品中分离乳酸菌具有重要研究意义和应用价值。

本文利用纯培养方法结合宏基因组16S rRNA测序技术研究摩洛哥地区自然发酵制品中的乳酸菌多样性，同时采用PacBio SMRT测序技术分析细菌菌群结构，进而保存摩洛哥地区自然发酵制品乳酸菌资源，以期为优良菌株筛选及其工业化应用提供宝贵的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

2份发酵橄榄汁样品 均来自摩洛哥卡萨布兰卡地区(西经7°41’，北纬33°32’)，将样品编号为GL1和GL2；TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司；KAPA HiFiHot-StartReady Mix PCR试剂盒 美国KAPA公司；5×TBE电泳缓冲液 天津基准化学试剂公司；实验所用培养基及其他试剂具体信息 参考文献[7]。

CDS8000型UPV凝胶成像分析系统 北京赛智创业科技有限公司；DYY-12电泳仪 北京六一仪器厂；ND-1000型微量紫外分光光度计 美国Nano Drop公司；AB/Life梯度PCR仪 美国AB公司；Pacifico SMRT RS II测序平台 美国PB公司；其他仪器具体信息 参考文献[7]。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集 采集一式两份发酵橄榄汁样品，一份加至已有碳酸钙和可溶性淀粉的无酶无菌采样管中(m碳酸钙∶m淀粉=1∶50)，用于样品中乳酸菌的分离鉴定；另一份加至无酶无菌的样品采集管中，加入DNA保护剂后，充分混匀，用液氮快速冷冻，密封移至低温冷采样箱，采集好的样品密封并标号，在低温条件下保存并尽快运回实验室，用于乳酸菌分离的样品到实验室后立即进行菌株分离，用于菌株多样性测序的样品冷冻保存后进行DNA提取和后续实验，并将提取DNA的样品在-80 ℃超低温冰箱保存。

1.2.2 乳酸菌的计数 取混匀的0.5 mL样品于4.5 mL浓度为0.85%的灭菌生理盐水中，采用稀释涂布平板法对2份样品进行乳酸菌活菌计数。取稀释梯度为10-5、10-6、10-7的稀释液于玻璃平皿中并加入30 mL加有放线菌酮和多粘菌素的MRS固体培养基采用八字摇匀法摇匀后置于37 ℃恒温培养箱中厌氧培养48～72 h。

1.2.3 乳酸菌的分离纯化及保存 配制加有0.1%抑菌素(V放线菌酮∶V多粘菌素=1∶1)的MRS和RCM的固体培养基，在121 ℃、15 min的条件下灭菌后使用，在培养基中加入放线菌酮和多粘菌素是为了在培养过程中抑制真菌和霉菌的生长，从而更好地分离出乳酸菌[8]。

采用稀释涂布平板法，将稀释梯度为10-5、10-6、10-7的样品稀释液均匀涂布在RCM和MRS固体培养基上，37 ℃恒温厌氧培养48 h[9]。待菌落形成后，观察菌落形状、边缘凹凸情况、光滑度等特征，选取形状、大小等特征不同的单个菌落，在固体培养基上进行二次划线纯化。实验过程中发现菌株在MRS固体培养基上生长较好，因此将纯化后的单个菌落接种于MRS液体培养基中培养。培养24～48 h后，将培养基离心倒掉上清加0.85%的灭菌生理盐水进行两次洗菌。取部分菌体涂片并进行革兰氏染色，之后在显微镜下观察，将革兰氏染色阳性，排列均一的菌株暂定为乳酸菌，并在剩余的菌泥中加入脱脂乳保护剂于无菌安瓿管中抽真空冷冻干燥后于-80 ℃保存[10]。

1.2.4 菌株DNA的提取、扩增和系统发育树的构建 使用TIANampBacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离纯化后并鉴定为乳酸菌的菌株DNA，使用方法详见试剂盒内说明书。提取完毕后对DNA浓度和纯度以及DNA提取质量进行检测。

将检测合格的基因组DNA稀释至100 ng/μL作为PCR扩增模板，进行16S rRNA基因序列扩增[11]。PCR扩增采用通用引物，正向引物27F(5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')，反向引物为1492R (5'-ACCTTGTTACGACTT-3')，PCR反应扩增体系(50 μL)和扩增条件参照乔健敏等[12]的16S rRNA基因序列扩增条件。

扩增完毕后，取约2 μL的PCR扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶[12]进行电泳检测。PCR扩增产物在1500 bp处有清晰条带，并无明显的拖尾现象，视为16S rRNA基因扩增产物满足测序要求。将扩增成功的PCR产物，在低温条件下寄到上海美吉生物技术有限公司，进行双向测序。

在NCBI数据库中(National Center for Biotechnology Information)将测序得到的菌株16S rRNA基因序列与模式株进行同源性比对，将同源性结果大于99%的菌株视为与模式菌株属于同一菌种。用MEGA 7.0软件构建系统发育树，进行遗传进化研究[13]。

1.2.5 样品宏基因组DNA的提取及文库构建和上机测序 使用OMEGA eZNA Soil DNA Kit试剂盒提取发酵橄榄汁样品中基因组的DNA，具体操作参照说明书。检验样品DNA的完整度、纯度以及浓度，将合格的样品置于-20 ℃冰箱备用。

使用KAPA HiFiHotStart Ready Mix PCR Kit将DNA作为模板进行PCR扩增，扩增使用细菌16S rRNA通用引物27F(5-AGAGTTTGATCMTG GCTCAG-3')1492R (5'- ACCTTGTTACGACTT-3')，扩增条件和PCR反应扩增体系如下。加入等体积的AMPure® PB 磁珠对扩增产物进行纯化，纯化后的片段用Qubit＠ dsDNA HS Assay Kit试剂盒检测DNA浓度，DNA浓度需在20～100 ng/μL。

具体PCR反应扩增体系(50 μL)和扩增条件参照刘文俊等[7]文献中条件。

经纯化后的PCR产物通过Pacific Biosciences SMRT bell TM Template Prep Kit试剂盒构建文库，用PacBio RS II仪器上机测序，按说明书具体操作，并分析结果[14]。

1.2.6 生物信息学分析 根据标记的Barcode将原始序列划分到每个样品中，然后去掉Barcode和引物序列，使用QIIME平台(v1.70)对高质量的序列进行生物信息学分析。具体分析过程参照刘文俊等[7]生物信息学分析过程。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌计数结果

对摩洛哥地区采集的两份发酵橄榄汁进行乳酸菌计数，结果为GL1活菌数为2.76±0.02 lg CFU/mL，GL2活菌数为2.92±0.09 lg CFU/mL。

结果表明，采集的2份发酵橄榄汁样品的乳酸菌活菌数在2.76～2.92 lg CFU/ml之间。可以看出两份样品中活菌数相差不大，说明在样品采集、运输过程中对样品的保护较好，并没有发生较大的活菌损失。

2.2 分离株菌落表型特征

采用纯培养方法对本研究中的2份发酵橄榄汁制品进行乳酸菌活菌分离及鉴定，通过显微镜观察、革兰氏染色和过氧化氢酶试验将分离到的52株分离菌株初步暂定为乳酸菌，其中包括24株杆菌。在分离过程中观察菌落形态发现，其表面光滑或粗糙、菌落边缘整齐、中央有凸起。之后进行革兰氏染色呈阳性，过氧化氢酶阴性，在显微镜下观察显示，呈单个、链状或分散状均匀排列(如图1)，由此初步断定为乳酸菌。最终筛选出52株乳酸菌，并进行下一步实验。

图1 乳酸菌显微镜检图片(1000×)Fig.1 Micrograph of lactic acid bacteria under microscope(1000×)

2.3 分离株DNA提取及PCR扩增效果分析

提取乳酸菌基因组DNA，并检测基因组DNA的浓度，结果表明所有分离株的基因组DNA的浓度均在100～1000 ng/L之间，纯度值(A260/A280比值)在1.8～2.0范围内。运用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的质量，结果显示大约在1500 bp的位置有一条清晰明亮的条带，该条带完整性较好，排列较为整齐，明亮且无拖尾(如图2)，因此菌株基因组PCR产物符合实验的要求。

图2 部分分离菌16S rRNA基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agar-sugar gel electrophoresis of 16S rRNA gene PCR amplification for partially isolates

2.4 系统发育树的构建和乳酸菌鉴定结果

测序得到的16S rRNA基因序列应用NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对，如若菌株与模式株序列同源性高于98%可将其归为同一类。如表1所示，52株菌中，有22株被归类于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，17株被归类为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，7株被归类于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，6株被归类于粪肠球菌(Enterococcus faecium)。

表1 摩洛哥地区自然发酵橄榄汁中乳酸菌分离株数量Table 1 The number of isolates of lactic acid bacteria in naturally fermented olive juice in Morocco

将52株自然发酵橄榄汁中乳酸菌分离株的16S rRNA基因序列，经GenBank数据库上传。

Neighbor-Joining系统发育树和菌株遗传进化比对结果如图3所示。本研究将52株分离株鉴定为乳酸菌的3个属4个种。IMAU98344、IMAU98358等菌株与模式菌株Lactobacillus paracaseisubsp.paracaseiATCC 25302T(D79212.1)聚为一类，故将其鉴定为Lactobacillus paracasei。IMAU98077、IMAU98141等菌株与模式菌株Lactococcus lactissubsp. lactisATCC 19435T(AB100803.1)聚为一类，且同源性为99%，故将其鉴定为Lactococcus lactissubsp.lactis。IMAU98357、IMAU98360等菌株与模式菌株Lactobacillus plantarumATCC 14917T(AF404710.1)聚为一类，同源性为99%，故将其鉴定为Lactobacillus plantarum。菌株IMAU98386与模式菌株Enterococcus faeciumATCC 19434T(AB012213.1)聚为一类，同源性为99%，故将其鉴定为Enterococcus faecium。

图3 摩洛哥地区自然发酵橄榄汁中部分分离株的16S rRNA基因序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences of the isolates from naturally fermented olive juice in Morocco

由表1可以看出，共分离出52株乳酸菌，其中样品GL1共分离出24株，包含11株Lactobacillus plantarum，2株Lactobacillus casei(paracasei)，9株Lactococcus lactis，2株Enterococcus faecium。样品GL2共 分 离 出28株 乳 酸 菌，包 含13株Lactococcus lactis，6株Lactobacillus plantarum，5株Lactobacillus casei(paracasei)，4株Enterococcus faecium，各样品菌株丰富度比较见图4。

2.5 发酵橄榄汁中细菌群落结构

通过对PacBio SMRT测序所得序列进行筛选后，本研究中两份样品基因组DNA中共获得2501条高质量的序列，在门水平上，共检测到5个细菌门分别是变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcu-Thermus)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)，平均相对含量分别是83.61%、14.67%、1.00%、0.62%、0.08%；在属水平上，共鉴定到40个细菌属，主要菌属为乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)。如图5所 示，样 品GL1Lactobacillus的 相 对 含 量 为48.61%，Lactococcus的相对含量为27.10%，样品GL2Lactobacillus的相对含量为61.69%，Lactococcus的相对含量为18.41%。相对含量大于1%的菌属还包括Shigella、Escherichia、Pediococcus、Acinetobacter、Pseudomonas等。在种水平上，共鉴定到80个细菌种，主要菌种有Lactococcus lactis、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus casei等，其中GL1的相对含量分别为21.43%、14.52%、9.22%、4.98%，GL2的相对含量分别为23.83%、19.00%、7.46%、10.78%(如图6)。

2.6 优势种属分析

2份摩洛哥发酵橄榄汁样品共分离出52株乳酸菌，分别为4个种。比较纯培养方法与PacBio SMRT测序检测方法，两种方法鉴定到的菌种属相对含量比较如表2所示，运用纯培养方法与PacBio SMRT测序检测方法鉴定出的最优势菌属均为Lactobacillus，分别占比为46.15%、55.15%；在种水平上两份样品共分离出22株Lactococcus lactis，占总分离株的42.31%，基于PacBio SMRT测序检测方 法 鉴 定 出Lactococcus lactis占 比 最 高，为22.63%，说明Lactococcus lactis为摩洛哥地区发酵橄榄汁制品中乳酸菌的优势种。其次还分离出16株Lactobacillus plantarum、7株Lactobacillus casei(paracasei)和6株Enterococcus faecium，占比分别为32.69%、13.46%和11.54%。由表2结果可以看出PacBio SMRT测序检测方法检测出Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei(paracasei)、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus zeae、Enterococcus faecium和Pediococcus acidilactici，占比分别为0.04%、7.88%、16.76%、8.34%、7.21%、0.04%和4.13%，其中Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus zeae和Pediococcus acidilactici等 在纯培养的过程中均没有被分离出，原因可能是这些菌种活菌含量较少，在纯培养时没形成优势菌，所以没有挑取到相应菌落。纯培养方法与PacBio SMRT测序检测方法检测出Lactobacillus plantarum含量差异较大，分别为32.69%和0.04%，出现此差异的原因可能在于两份样品中Lactobacillus plantarum活菌含量较高，导致在菌落随机挑选过程中，增加了其挑取比例，Lactobacillus plantarum菌种挑选的太多，因此相对含量占比很大。

图4 摩洛哥地区自然发酵橄榄汁中乳酸菌分离株丰富度比较Fig.4 The comparison of richness of lactic acid bacteria in natural fermented olive juice in Morocco

图5 样品中主要乳酸菌属水平的相对含量分析Fig.5 The relative abundance of lactic acid bacteria in the sample based on genera level

图6 样品中主要乳酸菌种水平的相对含量分析Fig.6 The relative abundance of lactic acid bacteria in the sample based on species level

对比结果发现样品的优势属和优势种存在差异，纯培养方法和PacBio SMRT 16S rRNA基因测序技术分离出的优势菌属为Lactobacillus占比分别为46.15%和55.15%，而优势菌种为Lactococcus lactis，占比分别为42.31%和22.63%。观察表2可以发现，纯培养方法分离出的Lactobacillus和Lactococcus百分比含量差异并不大，分别为46.15%和42.31%。PacBio SMRT16S rRNA测序检测方法在Lactobacillus中检测出的菌种种类很多，因此菌属相对百分比含量很高，但在Lactococcus中检测出的菌种只有Lactococcus lactis且含量占比很高，因此通过百分比含量来看，优势属为Lactobacillus，优势种为Lactococcus lactis，但比较分析纯培养方法和PacBio SMRT测序检测方法分离出的菌株可以看出，在摩洛哥地区采集的发酵橄榄汁样品中乳杆菌属具有菌种多样性，而乳球菌属菌种比较单一。

表2 发酵橄榄汁中不同方法获得的主要乳酸菌种属含量比较Table 2 Comparison of main lactic acid bacteria species content obtained by different methods in fermenting olive juice

3 讨论

在本研究中，采用纯培养方法与PacBio SMRT 16S rRNA基因测序技术对摩洛哥地区采集的发酵橄榄汁样品进行了细菌群落分析，早期纯培养的出现主要是为了解决研究者在研究过程中面临的多种微生物共存的复杂局面，目前我国对传统发酵食品中微生物的研究仍然主要应用微生物纯培养技术[15]，但是纯培养技术存在人为挑选误差而导致菌种分离不全的情况，因此在对样品研究时结合宏基因组PacBio SMRT 16S rRNA基因测序技术可以更完整地研究样品中的菌种多样性。

在本文中利用传统纯培养技术和PacBio SMRT 16S rRNA基因测序技术主要分离出的Lactococcus lactis、Lactobacillus plantarum和Lactobacillus casei(paracasei)广泛存在于各类发酵食品中。例如在传统乳制品、发酵蔬菜汁、酸菜、马奶酒、发酵泡梨、发酵肉制品、酸奶等都分离出植物乳杆菌[16]。丁冯玲等[17]对12份云南泡梨样品进行菌种分离与鉴定，鉴 定 出79株Lactobacillus plantarum、3株Lactobacillus casei(paracasei)，Lactobacillus plantarum为发酵泡梨中的优势菌；高璇等[18]在新疆酸马奶中共分离鉴定出20株对万古霉素具有耐受性的乳杆菌，其中L.plantarum为优势种。Lactobacillus casei(paracasei)是摩洛哥自然发酵制品中纯培养得到的优势菌种之一。研究表明干酪乳杆菌可以提高宿主免疫力且具有显著的益生效果[19]。本研究也分离到了肠球菌，肠球菌的存在主要有两个方面的原因。首先，肠球菌是植物源食品中的常见乳酸菌分离株；其次，橄榄汁为自然发酵生产，可能存在发酵过程中污染的问题。随着消费者对橄榄制品的青睐，橄榄制品中丰富乳酸菌资源的潜在益生功能和其他特性将会被进一步深入研究。

4 结论

本文运用传统纯培养分离鉴定方法从摩洛哥卡萨布兰卡地区采集的自然发酵橄榄汁样品中共分出52株菌株，鉴定为3个属，4个种，其中Lactococcus lactis为优势菌种，占总分离株的42.31%。应用三代测序技术对样品宏基因组测序分析，检测到5个门、40个属、80个细菌种，其中包括Lactococcus lactis、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei(paracasei)等乳酸菌菌种，Lactococcus lactis为优势菌种，占总分离株的22.63%。本研究获得了自然发酵橄榄汁中的乳酸菌资源，为优良乳酸菌的开发利用提供了宝贵的菌株。通过两种方法全面地了解摩洛哥地区自然发酵橄榄汁制品中丰富的乳酸菌组成及丰度。此研究结果不仅可以丰富乳酸菌的菌种资源，可以为后期自然发酵食品中乳酸菌的研究提供基础数据。