香菇多糖对奶牛乳房炎常见病原菌体外抑菌作用的研究

雷莉辉，关文怡，孙 健，蔡泽川

（北京农业职业学院，北京 102442）

香菇多糖（lentinan, LNT）是真菌多糖中应用较多的多糖之一。因其具有增强机体对多种细菌、病毒、寄生虫感染的免疫能力等生物活性在临床应用中日益受到重视[1]。有试验研究表明，香菇多糖对机体中体液免疫有一定的增强作用，它能提高机体中淋巴细胞的转化率，使白细胞数量升高，促进免疫球蛋白IgG的形成[2]。有研究表明，多糖在体外也能抑制细菌的生长和繁殖。但多糖对各类微生物抑菌作用的机制还不十分明确[3-4]。

本研究拟通过香菇多糖对引起某奶牛场乳房炎的主要病原菌的体外抑制作用的研究，为香菇多糖作为抑菌成分的开发利用提供理论依据，从而进一步促进奶牛养殖业的健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 从奶牛乳房炎病例中分离、纯化、鉴定得到的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌中各选取1株。

1.1.2 药物香菇多糖 购自西安岩昊生物科技有限公司，批号20180410。

1.1.3 营养基及其配制 营养琼脂培养基：牛肉膏1 g、酵母膏2 g、蛋白胨5 g、NaCL 5 g、琼脂15 g，加蒸馏水定容至1 000 ml，调pH为7.4。营养肉汤培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，加蒸馏水定容至1 000 ml，调pH为7.4，蒸馏水。

1.1.4 试验仪器及设备 电热炉、电子天平、电热恒温培养箱、电热鼓风干燥箱、生物安全柜、高压蒸汽灭菌器、游标卡尺、微量移液器、EP管、锥形瓶、培养皿（直径9 mm）、接种环、三角涂布器、滤纸等。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备 （1）营养琼脂培养基的制备。将除琼脂外的各成分溶解于蒸馏水中，充分搅拌并缓慢加热煮沸至完全溶解，校正pH后加入琼脂，分装至三角瓶，121°C高压灭菌15min，冷却后分装至培养皿，无菌检验后冷藏于4 ℃ 备用。（2）营养肉汤培养基的制备。将各成分溶解于蒸馏水中，搅拌并加热煮沸至完全溶解，分装于试管中，121 ℃ 高压灭菌15 min，无菌检验后冷藏于4 ℃ 备用。

1.2.2 香菇多糖溶液的准备 称取一定量的香菇多糖溶于高压蒸汽灭菌水中，旋涡振荡混匀，再浸泡约6 h后，配成300mg/L的溶液，先用4层纱布进行过滤，再用0.45 µm微孔滤膜过滤后分装。

1.2.3 细菌悬液的制备 把各试验菌种（金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）先接种在营养琼脂培养基平板上，37 ℃ 培养18～24 h，使菌种复壮，然 后挑取1个特征性菌落接种于10 ml的营养肉汤培养基中，37 ℃ 培养18～24 h，从该培养液中移取100 µl加到10 ml的营养肉汤培养基中继续37 ℃ 培养18～24 h，将肉汤中扩增培养的细菌用已灭菌的营养肉汤配制成含活菌数约106个/ml的细菌悬液，待用。

1.2.4 香菇多糖的体外抑菌试验 利用平板扩散法进行体外抑菌试验。取稀释后的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬液各200 µl，分别用三角玻璃涂布器均匀涂于营养琼脂培养基平板表面（每种菌做3个平皿），然后在每个平皿上用直径6 mm的打孔器按等边三角形的图案打孔，用9号注射器针头挑取孔内的琼脂，形成加样孔，注意每孔之间间距相等且不小于20 mm。再将该平板于酒精灯火焰上略微加热，使打孔后的琼脂底部与平皿再次紧密贴合，防止加入的药液从底部的缝隙串孔。将制备好的香菇多糖溶液用微量移液器分别加入接种有金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的琼脂平板中，其中两孔加香菇多糖溶液作为平行样，另一孔加灭菌生理盐水作为对照。每孔以加满但不溢出为准，且每个平皿上的3个孔加样量基本保持一致。37 ℃ 培养24 h，记录抑菌圈直径大小。

1.2.5 香菇多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的体外最低抑菌浓度（MIC）测定 用倍比稀释法将300mg/L的香菇多糖溶液稀释成浓度为150、75、37.5、18.75、9.375mg/L 5个浓度梯度，按上述1.2.4中的方法，每个菌种做6个平皿，在每个平皿上打5个加样孔，分别加入5个浓度梯度的香菇多糖溶液。测量并记录结果，取其平均值，以出现抑菌圈的最低浓度为最低抑菌浓度。

2 结果与分析

2.1 香菇多糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抑菌效果

通过平板打孔法测定香菇多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的体外抑菌效果，结果见表1。

表1 香菇多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的 抑菌圈平均直径 （mm）

由表1可知，香菇多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌这2种引起奶牛乳房炎的主要病原菌均有一定的体外抑菌效果，且对大肠杆菌的抑制作用明显强于对金黄色葡萄球菌的抑制作用。

2.2 香菇多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的体外最低抑菌浓度（MIC）测定结果

香菇多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的体外最低抑菌浓度（MIC）测定结果见表2。

表2 香菇多糖的体外最低抑菌（MIC）浓度试验结果

由表2可知，香菇多糖的抑菌效果随浓度的降低而呈现下降趋势，香菇多糖对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为37.5mg/L，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为18.75mg/L。

3 讨论

根据本试验结果，可初步证明香菇多糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有一定的体外抑制作用，对大肠杆菌的抑制作用较强，对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱；香菇多糖对同一种病原菌的抑制作用与香菇多糖的浓度呈正相关，浓度越高，抑菌效果越明显，香菇多糖对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为37.5mg/L，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为18.75mg/L。

目前已报道的可引起奶牛乳房炎的病原微生物至少有150种，主要为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌等[5]。随着抗生物在乳房炎治疗过程中的广泛使用，细菌耐药性日益严重，迫切需要有生物活性作用且不产生耐药性的生物活性物质应用于乳房炎的临床治疗。本试验为香菇多糖对细菌的体外抑菌活性研究，在大多数报道中，

体内抑制试验效果好于体外抑制实验[6]。本研究证实香菇多糖对引起奶牛乳房炎的两种主要病原菌有明显的体外抑菌效果，若将香菇多糖添加于奶牛的饲料或饮水中，其抑菌效果将能更好地发挥，同时也为香菇多糖应用于奶牛乳房炎的治疗提供了理论依据。在后续的研究中，笔者将对香菇多糖在奶牛养殖过程中的添加剂量进行进一步的探索。