灭活枯草芽孢杆菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

赵霏霏，辛雅明，杨 丹，杨银凤*

(1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区基础兽医学重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018)

防御素是一类具有6个保守半胱氨酸的带正电荷的小分子肽，是广泛存在于动物中[1]的先天免疫重要组成成分，具有广谱的抗微生物活性和免疫调节功能[2-3]。哺乳动物防御素根据其结构中半胱氨酸的位置以及形成二硫键的连接方式可进一步分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素3种类型。其中β-防御素是脊椎动物中最大的防御素家族，最初是从牛的上皮细胞和嗜中性粒细胞中分离出来的[4]，随后的研究几乎在所有的脊椎动物中都鉴定出了β-防御素[5]。研究发现β-防御素主要是由上皮细胞和免疫细胞群分泌[6]，主要通过发挥抗微生物活性作用和免疫调控作用来提高机体的抗病能力[7]。

饲用益生菌是一类绿色、高效、无残留的饲料添加剂，在2020年饲料全面禁止添加抗生素后越来越引起人们的关注[8]。常用的饲用益生菌添加剂主要有芽孢杆菌类、乳酸菌类以及酵母菌等，其中枯草芽孢杆菌是农业部《饲料添加剂品种目录(2013)》中允许添加的两种饲用芽孢杆菌之一。枯草芽孢杆菌是一种能产生芽孢的革兰氏阳性兼性厌氧菌，具有耐酸、耐高温、抗逆性强、耐胃肠道各种酶，可以很好的定植于胃肠道内消耗胃肠道内的氧气造成厌氧环境维持胃肠道内的微生物平衡，对动物的健康和生长有积极的影响。相关研究表明在畜禽日粮中添加枯草芽孢杆菌可以提高生产性能[9]，增强畜禽的免疫功能[10]，但大多研究是从增强免疫细胞活性方面来阐明枯草芽孢杆菌增强机体免疫功能的，在诱导β-防御素表达方面研究的较少。2015年王佩等[11]用不同浓度的枯草芽孢杆菌刺激绵羊瘤胃上皮细胞(ovine rumen epithelial cells，ORECs)，发现活的枯草芽孢杆菌可以显著上调绵羊β-防御素-1(sheep β-defesin-1，SBD-1)的表达，但是其诱导SBD-1表达的有效成分并不确定。本试验采用qPCR和ELISA方法检测用不同浓度热灭活枯草芽孢杆菌刺激不同时间的体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞中SBD-1 mRNA和蛋白表达量的变化，验证枯草芽孢杆菌诱导SBD-1的有效成分是否会被热灭活，为后续确定枯草芽孢杆菌诱导SBD-1有效成分的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 绵羊瘤胃组织 绵羊瘤胃上皮细胞分离培养的组织取自于呼和浩特市北亚屠宰场。

1.1.2 供试菌株 枯草芽孢杆菌CMCC63501购于中国微生物菌种网。

1.1.3 主要试剂 DMEM/F12培养基，Gibico公司产品；青链霉素，Gibico公司产品；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司产品；DMSO，北京索莱宝科技有限公司产品；RNA提取试剂盒Axygen公司产品；Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，宝生物工程(大连)有限公司产品；TB green® Premix ExTaqTM，宝生物工程(大连)有限公司产品；绵羊β-防御素-1 ELISA试剂盒，武汉新启迪生物科技有限公司。

1.1.4 主要仪器 CO2细胞培养箱，美国Thermo Fisher Scientific公司产品；倒置显微镜，Olympus公司产品；实时荧光定量PCR仪，美国ABI公司产品；多功能酶标仪，Bio Tek公司产品。

1.2 方法

1.2.1 原代绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)的培养 原代ORECs的培养参照金鑫等[12]建立的ORECs培养方法进行。

1.2.2 枯草芽孢杆菌的培养及灭活菌的制备 将枯草芽孢杆菌的菌种接种于LB培养基中，37℃、200 r/min摇菌24 h，按照倍比稀释的方法用无抗生素的DMEM/F12调整菌落浓度为107、108、109、1010、1011CFU/mL。在130℃、30 min的条件下使其完全失活。取菌液均匀涂布于固体LB培养基平板上，培养48 h后观察，无枯草芽孢杆菌菌落生长，即灭活成功可用于后续刺激试验。

1.2.3 灭活枯草芽孢杆菌对ORECs的刺激试验 将ORECs接种于6孔板中，待细胞铺满板底85%以上时弃掉培养基，用含青链霉素的PBS清洗3次，加入2 mL DMEM/F12培养基，对细胞进行24 h的饥饿处理。饥饿处理完成后每孔分别加入200 μL的5种不同浓度的灭活枯草芽孢杆菌，同时用等体积的DMEM/F12培养基作为空白对照，放入37℃温箱内刺激2 h。用PBS清洗3次，继续诱导8 h，利用RNA提取试剂盒(Axygen)分别提取各组ORECs总RNA反转录为cDNA。qPCR技术检测SBD-1 mRNA的相对表达量，筛选出SBD-1 mRNA表达量最高的刺激浓度为最佳刺激浓度。用最佳刺激浓度的灭活枯草芽孢杆菌在37℃温箱刺激ORECs 2h，继续分别诱导2 h、4 h、8 h、12 h后分别提取各组ORECs总RNA。用qPCR技术检测SBD-1 mRNA的相对表达量。收集所有刺激组和对照组的细胞培养上清液存储在-80℃，用于后续试验。

1.2.4 MTT法检测灭活枯草芽孢杆菌对ORECs的毒性作用 生存状态良好的细胞传到96孔板中，待细胞铺满板底85%以上时分别加入5种不同浓度的灭活枯草芽孢杆菌刺激ORECs 8 h和诱导SBD-1表达量最高的灭活枯草芽孢杆菌浓度刺激ORECs 2 h、4 h、8 h、12 h，同时单独培养细胞作为对照组，空白孔只加100 μL DMSO作为空白组。诱导刺激完成后，在每孔加入100 μL的DMEM/F12培养基和10 μL MTT(5 mg/mL)，在37℃、5% CO2条件下孵育4 h，小心吸取培养上清弃掉，然后每孔加入100 μL DMSO，待结晶充分溶解后，使用酶标仪检测490 nm波长的OD值，通过计算细胞存活率来评定灭活枯草芽孢杆菌对ORECs的毒性作用。细胞存活率=[(试验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)]×100%

1.2.5 ORECs总RNA的提取和反转录 按总RNA提取试剂盒(Axygen)的说明书进行操作，提取ORECs的总RNA；使用酶标仪检测所提RNA在260 nm和280 nm波长的OD值，分析其浓度和纯度，同时对RNA做凝胶电泳试验检测其完整性。然后将RNA浓度调整到统一浓度，按照去基因组DNA的反转录试剂盒(TaKaRa)的说明书进行反转录，得到cDNA保存在-20℃备用。

1.2.6 qPCR方法检测SBD-1 mRNA的表达量 内参基因β-actin和目的基因SBD-1的特异性引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成(表1)。qPCR试验按照GreenTB®Premix Ex TaqTM说明书进行操作，所有反应体系均在冰上配制，在QuantStudioTM7Flex Real-Time PCR System上进行反应。根据反应得到的CT值，用2-ΔΔCt法计算出ORECs的SBD-1 mRNA的相对表达量。qPCR反应结束后，取10 μL的产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，检测其扩增产物是否特异单一。

表1 引物序列及扩增片段大小

1.2.7 ELISA方法检测SBD-1蛋白的表达 将保存于-80℃的细胞培养上清在冰上融化，同时将绵羊SBD-1 ELISA试剂盒从-20℃取出平衡至室温后按照试剂盒说明书进行ELISA试验。用酶标仪测定各个样品在450 nm处的OD值，使用GraphPad Prism 7绘制标准曲线得到二次多项式拟合方程，并求出各样品的蛋白表达量。

1.2.8 结果统计分析 分别使用SPSS和GraphPad Prism 7软件对试验相关数据结果进行统计学分析和图标的制作。试验结果均用“平均值±标准差”表示。其中P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 灭活枯草芽孢杆菌对ORECs的毒性作用

本试验用与刺激试验相对应的灭活枯草芽孢杆菌浓度和时间刺激ORECs，之后用MTT法测定各组ORECs的存活率，以确定灭活枯草芽孢杆菌对ORECs的毒性作用。结果如图1所示，不同浓度的灭活枯草芽孢杆菌刺激ORECs，在试验时间内细胞存活率同对照组相比差异不显著(P>0.05)，表明试验用的灭活枯草芽孢杆菌浓度和刺激时间对ORECs的细胞活性几乎没有影响。

A.不同浓度灭活枯草芽孢杆菌对ORECs的活性影响; B.灭活枯草芽孢杆菌刺激不同时间对ORECs的活性影响

2.2 总RNA纯度及质量分析

将ORECs总RNA经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，结果出现了RNA具有代表性的28S、18S和5S 3个条带，条带清晰且无拖尾(图2)，说明提取的RNA完整无降解。酶标仪检测在260 nm/280 nm处OD值比值在2.0左右，说明所提RNA无蛋白及多糖污染，可以用于后续试验。

图2 ORECs总RNA琼脂糖凝胶电泳图

2.3 β-actin和SBD-1基因qPCR扩增产物特异性分析

2.3.1 β-actin和SBD-1基因扩增曲线和熔解曲线分析 以所提ORECs总RNA为模板反转为cDNA，以β-actin为内参基因，SBD-1为目的基因，经qPCR反应进行扩增，结果如图3所示，扩增曲线出现标准的S型曲线，表明扩增效果良好(图3A、B)；经熔解曲线分析β-actin和SBD-1，分别在88.5℃和84℃出现单一的峰，没有异常增宽的峰和杂峰，且主峰对应Tm值与预期产物的Tm相一致(图3C、D)。

A.β-actin的扩增曲线；B.SBD-1的扩增曲线；C.β-actin的溶解曲线；D.SBD-1的溶解曲线A.Amplification curve of β-actin; B.SBD-1 amplification curve; C.The dissolution curve of β-actin; D.Dissolution curve of SBD-1

2.3.2 qPCR产物琼脂糖凝胶电泳结果分析 将β-actin和SBD-1的qPCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果如图4所示，在208 bp和133 bp的位置上各出现一条单一的条带，与引物设计的预期大小相符，扩增条带整齐且无引物二聚体，可以确定qPCR产物分别为β-actin和SBD-1的特异性产物。

Marker:DL 2 000

2.4 灭活枯草芽孢杆菌刺激ORECs对SBD-1 mRNA表达量的影响

为确定灭活枯草芽孢杆菌对ORECs SBD-1 mRNA表达量的影响，首先用107、108、109、1010、1011CFU/mL的灭活枯草芽孢杆菌刺激ORECs 2 h，同时设置未刺激组作为空白对照，诱导培养8 h后，通过数据分析，结果如图5 A所示，107CFU/mL组与空白对照组相比差异不显著(P>0.05)，其他浓度的刺激组与空白对照组相比SBD-1 mRNA表达量均增加，并且呈极显著差异(P<0.01)。随着灭活枯草芽孢杆菌浓度的增加，SBD-1 mRNA表达量呈现出先增加后降低的趋势，在刺激浓度为1010CFU/mL达到峰值，之后SBD-1 mRNA表达量开始下降。选取诱导SBD-1表达量最高的1010CFU/mL浓度灭活枯草芽孢杆菌刺激ORECs 2 h、4 h、8 h、12 h后，发现随着诱导时间的增加SBD-1 mRNA的表达量随着增加，到8 h的时候达到峰值，并且与空白对照组差异极显著(P<0.01)，8 h以后SBD-1 mRNA的表达量呈下降趋势(图5 B)。通过以上分析可知，1010CFU/mL的灭活枯草芽孢杆菌刺激ORECs 8 h时SBD-1 mRNA表达量最高。

A.不同浓度灭活枯草芽孢杆菌对ORECs SBD-1 mRNA表达的影响；B.最佳刺激浓度诱导不同时间对ORECs SBD-1 mRNA表达量的影响。**.P<0.01；*.P<0.05；

2.5 灭活枯草芽孢杆菌对ORECs SBD-1蛋白表达量的影响

2.5.1 ELISA试验标准曲线的建立 ELISA试验建立的标准曲线如图6所示，横坐标为不同浓度标准品在450 nm波长的吸光值，纵坐标为标准品的浓度，其二次多项式拟合方程为y=347.35x2+1972.8x-154.3，相关系数R2为0.998 5，说明所测的样品蛋白浓度可以用此标准曲线计算。

图6 ELISA标准曲线

2.5.2 灭活枯草芽孢杆菌对ORECs SBD-1蛋白表达量的影响 根据标准曲线的标准拟合曲线计算出SBD-1的表达量，经过数据处理分析，结果如图7所示，SBD-1在蛋白水平上与mRNA水平的表达趋势基本一致，表达趋势也呈先上升后下降的趋势，在刺激浓度为1010CFU/mL时蛋白表达量达到峰值，与对照组相比差异极显著(P<0.01)。用1010CFU/mL刺激ORECs

A.不同浓度灭活枯草芽孢杆菌对ORECs SBD-1蛋白表达影响；B.最佳刺激浓度诱导不同时间对ORECs SBD-1蛋白表达量影响。**P<0.01

2 h、4 h、8 h、12 h时SBD-1的表达量从4 h开始与对照组相比差异极显著(P<0.01)，并随着刺激时间的增减，SBD-1的表达量呈递增的趋势。与mRNA水平不同的是刺激12 h后的蛋白浓度高于10 h刺激组。

3 讨论

近年来畜牧业迅速的发展，从之前的散养、小规模养殖，逐渐发展为集约化、规模化养殖，由于饲养数量和密度的增加，容易导致病原微生物的富集，饲养动物机体的抵抗力下降，饲养的动物更加容易患病，这增加了养殖业的风险。抗生素虽然可以防治动物疾病的发生和促进动物生长[13]，但是其容易在畜产品内残留，以及引起细菌的耐药性等缺点，甚至影响人类的健康，因此控制抗生素在畜牧业生产中的用量，开发取代抗生素的药品成为了研究的新热点[14]。β-防御素是机体自身分泌的抗微生物活性肽，在维持动物自身健康上发挥重要的作用，但是在体内固有表达量很少，而且用化学、生物工程等手段合成成本太高，这些原因造成了防御素难以规模化生产，不能广泛应用于生产实践[15]。β-防御素具有可诱导性，用合适的诱导剂可以增加β-防御素表达量，从而增强机体对病原微生物的抵抗力，这也是一种有效的利用防御素的方法[16]。

本试验结果发现灭活枯草芽孢杆菌可以诱导ORECs SBD-1 mRNA的表达，灭活枯草芽孢杆菌以不同浓度诱导8 h时，SBD-1的mRNA和蛋白水平都呈先上升后下降的趋势，并且都是在浓度为1010CFU/mL时达到峰值。用浓度为1010CFU/mL的灭活枯草芽孢杆菌诱导ORECs 2 h、4 h、8 h、12 h，SBD-1 mRNA表达量随着刺激时间的增加先上升后下降且在8 h时的表达量最大，这与本课题组前期研究的活枯草芽孢杆菌诱导ORECs SBD-1 mRNA的表达的结果相一致。黎观红等[17]等人用鼠李糖乳杆菌刺激鸡小肠上皮细胞发现，鼠李糖乳杆菌可以显著提高鸡抗菌肽AvBD9的表达，菌液浓度为2×106CFU/mL刺激12 h AvBD9表达达到峰值。金鑫等[18]研究发现酿酒酵母菌可显著提高ORECs SBD-1的表达，且菌液浓度为5.2×107CFU/mL刺激绵羊瘤胃上皮细胞12 h后，SBD-1mRNA表达达到峰值。张曼等[19]发现酿酒酵母菌β-葡聚糖可诱导ORECs SBD-1的表达，β-葡聚糖浓度为10 μg/mL刺激ORECs 2 h时SBD-1 mRNA表达达到峰值。金鑫等[20]发现酿酒酵母菌甘露聚糖可诱导ORECs SBD-1的表达甘露聚糖浓度为50 μg/mL刺激ORECs 4 h时SBD-1 mRNA表达达到峰值。以上研究揭示了益生菌及其细胞成分可以诱导防御素的表达，益生菌细胞的不同成分，在诱导防御素的表达上最佳的刺激浓度和时间也不相同。通过以上论证我们可推测，枯草芽孢杆菌诱导ORECs SBD-1表达的有效成分没有被热灭活，那么枯草芽孢杆菌诱导ORECs SBD-1表达的有效成分可能是热稳定性较强的细胞成分，为后续确定枯草芽孢杆菌诱导ORECs SBD-1表达的有效成分的研究提供了思路。

本试验通过体外细胞试验证明了热灭活的枯草芽孢杆菌可以显著提高ORECs mRNA和蛋白的表达，且呈浓度和时间依赖性，为枯草芽孢杆菌诱导SBD-1表达的有效成分的研究提供了基础。