黄芪甲苷对博来霉素肺纤维化模型小鼠miR-29b及其相关因子表达的影响

童佳欢 刘肇恒 龙杞 郝庆勋 王域辰 焦扬

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一种原因尚不明确的，以肺部弥漫纤维化伴蜂窝囊样改变为特征的疾病。患者诊断后中位生存期仅2～3年。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是促进肺纤维化发生发展的最重要因素之一。研究发现，TGF-β1是MicroRNA-29b(miR-29b)的下游靶基因之一，miR-29b的过表达可以直接抑制TGF-β1/Smad3信号通路，从而达到抗纤维化的作用[1-2]。此外，miR-29b可显著提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性，降低活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，从而抑制氧化应激，减轻肺纤维化[3-4]。miR-29b这种“多途径”“多靶点”作用特点，与中医学的调整阴阳平衡，扶正祛邪的治疗理念相吻合。

课题组总结多年临床经验，认为IPF以肺气亏虚为本，临床运用肺痹汤治疗取到了较好的疗效[5]。课题组通过动物及细胞实验研究证实，肺痹汤可调节肺组织TGF-β1水平，对成纤维细胞的TGF-β1/smad信号通路具有调控作用[6-7]。肺痹汤以黄芪为君，黄芪既能补益肺气，亦能通调血脉。实验研究发现，黄芪总皂苷可抑制博来霉素诱导的肺组织炎症反应，下调TGF-β1表达[8]，抑制肺纤维化发展，其中黄芪甲苷能显著抑制博来霉素诱导的小鼠氧化应激状态，延缓 IPF进程[9-10]，但其抗肺纤维化机制仍需深入研究。本实验基于miR-29b，研究黄芪甲苷对博来霉素肺纤维化模型小鼠的干预作用，探讨其防治肺纤维化的可行性及作用机制，为临床治疗肺纤维化提供思路和方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级C57BL雄性小鼠40只，体质量(22±2)g，购于北京维通利华有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2006-009，饲养于北京中医药大学第二附属医院实验动物中心。饲养环境：室温22～26℃，相对湿度60%～80%，12小时/12小时明暗周期照射。

1.2 实验药物及试剂

黄芪甲苷(质量分数≥98%)，购自上海源叶生物科技有限公司；miR-29b模拟剂(批号：miR4CM001)、miR-29b模拟剂阴性对照药(批号：RIBOCSUTOM001)购于广州锐博生物科技有限公司；HE染色试剂盒、Masson三色染色液购于北京索莱宝科技有限公司；羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)试剂盒购于南京建成有限公司；MDA试剂盒(货号：DG30429M)、ROS试剂盒(货号：DG30626M)、SOD试剂盒(货号：DG30430M)购于北京冬歌博业生物科技有限公司。

1.3 模型制备

实验小鼠适应性喂养1周后随机分为空白组8只，造模组32只。造模组小鼠称重后，以异氟烷麻醉。将小鼠上牙迅速挂于悬线，使小鼠呈竖直位，用弯镊将小鼠舌头拽出，用100 μL移液枪向气管内快速滴入博来霉素溶液(2 u/kg)后，保持竖直状态片刻，使药液呛入气管中，旋转1分钟，使液体在小鼠肺内均匀分布，随后放回鼠笼，待自然苏醒。空白组以相同方法滴入等量PBS。

1.4 分组及给药

造模组小鼠成功造模后，随机分为模型组、miR-29b组、miR-29b阳性对照药组(简称NC组)、黄芪甲苷组，每组8只。造模1天后开始给药，每天上午9点给药。黄芪甲苷组以黄芪甲苷40.8 mg/(kg·d)灌胃，空白组、模型组、miR29组、NC组分别以生理盐水10 mL/(kg·d)灌胃。参照文献[11]，miR-29b组以miR-29b模拟剂10 mg/(kg·3d)气道内滴入，NC组以miR-29b模拟剂阴性对照药10 mg/(kg·3d)气道滴入，空白组、模型组、中药各组以等量PBS气道滴入。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 一般状态观察 观察各组小鼠精神状态、毛发变化、进食、饮水及体质量、呼吸情况变化，记录小鼠死亡情况，进行死亡原因分析。

1.5.2 肺组织病理学染色 将小鼠左肺置于中性福尔马林液中固定，常规石蜡包埋切片，用HE染色观察肺组织肺泡炎程度；Masson染色观察肺组织肺纤维化程度。观察各组小鼠肺组织病理学改变，主要包括肺泡炎性细胞浸润、肺组织水肿、肺间质纤维化等。

1.5.3 肺组织羟脯氨酸检测 取小鼠右侧肺组织放入液氮速冻，保存在-80℃，采用羟脯胺酸试剂盒(碱水解法)测定肺组织中羟脯胺酸含量。

1.5.4 Elisa检测血清中SOD、MDA、ROS水平 小鼠称重后用异氟烷麻醉，摘眼球取血，分离上血清，采用Elisa试剂盒检测血清中SOD、MDA、ROS水平。

1.5.5 qPCR法检测肺组织中miR-29b、TGF-β1、smad3水平 根据目的基因设计引物(见表1)，提取总RNA检测纯度，运用反转录合成cDNA，建立扩增体系，读取扩增曲线、溶解曲线及目的基因的相对表达量。

表1 引物序列

1.5.6 Western-blot检测肺组织中TGF-β1、smad3、P-smad3水平 将少量肺组织块置于1～2 mL匀浆器中球状部位，充分研磨组织块。加入400 μL的裂解液进行匀浆，置于冰上。待样本充分裂解完成后，在4°C下12000 rpm，离心5分钟，取上清于-20℃保存。制作标准曲线，检测样品蛋白含量，进行电泳、转膜、免疫反应、化学发光、显影、定影，最后进行凝胶图像分析。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况比较

空白组小鼠精神状态好，活泼好动，毛发光泽，呼吸平稳。模型组及NC组小鼠精神较差，少动，体质量减轻，毛发干枯，可见喘息气促。miR-29b组及黄芪甲苷组小鼠症状较轻。

从第1天到第9天，除空白组外，各组小鼠体质量均下降，第9天至第28天，各组小鼠体质量逐渐增加。与空白组相比，模型组及黄芪甲苷组第5、9、13、17、21、25、28天体质量减轻(P<0.05)，NC组第5、9、17、21、25、28天体质量减轻(P<0.05)，miR-29b组第9、28天体质量减轻(P<0.05)。与模型组和NC组相比，空白组、miR-29b组和黄芪甲苷组第9天时体质量较高(P>0.05)。见表2。

表2 各组博来霉素肺纤维化模型小鼠体质量变化比较

2.2 各组小鼠肺组织病理比较

空白组无炎性细胞浸润，管腔无渗出，无胶原纤维沉积。模型组和NC组可见管腔大量炎性渗出，肺泡间隔增宽、充血，肺泡破坏严重，Masson染色可见大量胶原纤维沉积，纤维结节生成。miR-29b组和黄芪甲苷组可见部分炎性细胞浸润，Masson染色可见少量胶原纤维沉积。见图1～2。

注：A空白组，B模型组，C miR-29b组，D NC组，E黄芪甲苷组。

2.3 各组小鼠肺组织HYP含量比较

与空白组相比，模型组、miR-29b组、NC组、黄芪甲苷组羟脯氨酸含量均升高(P<0.05)。与模型组相比，miR-29b组和黄芪甲苷组羟脯氨酸含量较低(P<0.05)。见表3。

表3 各组博来霉素肺纤维化模型小鼠肺组织HYP含量比较

2.4 各组小鼠血清SOD、MDA、ROS含量比较

与空白组相比，模型组、miR-29b组和黄芪甲苷组的SOD含量减少，MDA和ROS含量增加(P<0.05)，NC组的SOD显著减少、MDA增加(P<0.05)。与模型组相比，miR-29b组的MDA、ROS含量减少(P<0.05)，NC组的SOD含量减少(P<0.05)，黄芪甲苷组的SOD含量明显增多，MDA和ROS含量减少(P<0.05)。与NC组相比，miR-29b组和黄芪甲苷组SOD含量增加，ROS含量减少(P<0.05)。见表4。

表4 各组博来霉素肺纤维化模型小鼠血清SOD、MDA、ROS含量比较

2.5 各组小鼠肺组织TGF-β1、Smad3、miR-29b mRNA含量比较

与空白组相比，模型组和NC组的TGF-β1、Smad3基因表达量明显升高，miR-29b基因表达量减少(P<0.05)；miR-29b组的Smad3基因表达量减少(P<0.05)。与模型组相比，miR-29b组和黄芪甲苷组的Smad3表达量减少、miR-29b表达量升高(P<0.05)。与NC组相比，miR-29b组的Smad3表达量减少、miR-29b表达量升高(P<0.05)，黄芪甲苷组Smad3表达量减少(P<0.05)；与miR-29b组相比，黄芪甲苷组的Smad3含量升高(P<0.05)。见表5。

表5 各组博来霉素肺纤维化模型小鼠肺组织TGF-β1、Smad3、miR-29b mRNA含量比较

2.6 各组小鼠肺组织TGF-β1、Smad3、P-smad3蛋白含量比较

与空白组相比，模型组和NC组的TGF-β1、P-smad3蛋白含量升高(P<0.05)。与模型组相比，miR-29b组和黄芪甲苷组的TGF-β1、P-smad3蛋白含量减少(P<0.05)。与NC组相比，miR-29b组的TGF-β1、P-smad3蛋白含量减少(P<0.05)，黄芪甲苷组P-smad3蛋白含量减少(P<0.05)。见表6、图3。

表6 各组博来霉素肺纤维化模型小鼠肺组织TGF-β1、Smad3、P-smad3蛋白含量比较

图3 各组博来霉素肺纤维化模型小鼠肺组织TGF-β1、Smad3、P-smad3蛋白含量表达

3 讨论

肺纤维化发病机制尚未完全明了，已有的研究认为多种因素共同参与了肺纤维化的发生、发展过程。MicroRNA是一种非编码的单链小分子RNA，通过与mRNA互补配对的方式，在转录后调控蛋白的表达。研究发现，同一种microRNA可以调控多种mRNA的表达，而同种mRNA也可能受到不同的microRNA调控[12-13]。miR-29家族由miR-29a、miR-29b、miR-29c三种成员构成，这三种成员之间仅存在2～3个核苷酸位点的差异，且具有相同的种子序列，因此它们作用的靶基因也往往相同，具有高度保守性[14]。miR-29可直接抑制胶原纤维生成，或通过多种细胞因子抑制肺纤维化[15]。氧化应激是触发肺纤维化形成的重要机制之一，肺损伤后释放大量的ROS，使肺组织发生过氧化，刺激胶原蛋白的合成与分泌[16]。另一方面，ROS也可通过激活TGF-β1/Smad3信号通路，增加结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶的表达，促进细胞外基质的重构和肺纤维化[17-18]。研究表明，miR-29家族的过表达可以降低ROS和MDA含量，清除氧化应激产物，同时显著提高SOD含量，提高机体抗氧化水平，从而减轻肺纤维化程度[3,19]。miR-29也可直接作用于靶基因TGF-β1的3’-UTR[20]，抑制TGF-β1表达，并通过TGF-β1/Smad3信号通路的抑制作用[21-22]，减轻肺纤维化。这种多靶点、多途径的调控方式与中医整体观具有相似性。

肺纤维化在古代文献中无对应病名，根据其临床表现，大多数学者认为可以归为“肺痿”“肺痹”范畴。《医门法律》有言“肺痿者，肺气痿而不振也”，《辨证录》中说：“肺痹之成于气虚，尽人而不知也，……然肺痹即气痹也。”肺纤维化多因气虚而起，属本虚标实之证，临床也常以补气之品治疗肺纤维化。研究发现，补气药在治疗肺纤维化的过程中使用频率较高，其中黄芪为最常用的补气药之一[23]。

近年来对黄芪研究发现，黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分，可有效改善抗氧化酶活性，抑制氧化应激反应[24]，也可降低肺组织羟脯氨酸含量，下调致纤维化因子TGF-β1表达水平，明显改善博来霉素诱导的肺纤维化程度[25]。但黄芪甲苷调节TGF-β1的机制还需进一步研究，对microRNA的干预也有待更多探索。

本实验研究以miR-29b为切入点，研究黄芪甲苷对肺纤维化小鼠的作用机制。结果表明，博来霉素肺纤维化模型组小鼠早期出现体质量下降，miR-29b可以减轻小鼠体质量下降的程度，黄芪甲苷也有缓解体质量减轻的趋势。病理结果显示，模型小鼠肺组织结构破坏严重，大量胶原纤维沉积，黄芪甲苷可以减少胶原纤维形成，减轻肺纤维化程度。羟脯氨酸是胶原纤维的主要成分，本实验结果提示黄芪甲苷可以通过减少羟脯氨酸含量抑制肺纤维化。同时，黄芪甲苷可以有效增加SOD含量，抑制MDA的生成，提示黄芪甲苷具有抑制氧化反应的作用。进一步实验发现，模型组小鼠肺组织miR-29b的基因表达减少，而黄芪甲苷可以一定程度上提高miR-29b的表达，说明黄芪甲苷对miR-29具有一定的调控作用。黄芪甲苷也可减少Smad3基因的表达，抑制其磷酸过程，减少了P-Smad3蛋白水平，同时也可以减轻TGF-β1蛋白含量，从而起到调控TGF-β1/Smad3信号通路的作用。

综上所述，本研究发现黄芪甲苷可以通过调控miR-29b减轻氧化应激水平，抑制TGF-β1/Smad3信号通路，减少胶原沉积，从而改善肺纤维化病理损伤。但黄芪甲苷的临床干预效果仍需进一步研究。