蛭龙活血通瘀胶囊拆方组分抗大鼠动脉粥样硬化及降血脂作用

耿 路，张诗意，廖慧玲

（西南医科大学中西医结合学院，四川泸州 646000）

动脉粥样硬化（atherosclerosisi，AS）是一种临床上常见的血管病变，是诸多缺血性心脑血管疾病共同的病理基础，是全世界最主要的致死原因之一[1]。迄今为止，有关AS的发病机制已有许多学者各抒己见衍生出许多不同学说，如脂质浸润、损伤免疫应答、炎性反应及血流动力学学说等[2]，然而AS的病理机制复杂，任意一种学说均不能单独全面的解释其完整的发生机制。异常血脂是AS发生发展最重要的因素。大量流行病学资料显示AS的严重程度与血清总胆固醇（total cholesterol，TC）水平呈正相关，低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）升高是AS 重要的病理基础，在血脂异常中扮演重要角色[3]。而高密度脂蛋白胆固醇（high-den⁃sity lipoprotein cholesterol，HDL-C）是AS 的保护因素，有益于心血管，升高HDL-C水平可作为抗AS的治疗靶点[4]。因此降低血清TC、LDL-C，升高HDL-C对防治AS有积极意义，且大量临床研究表明中医药在心脑血管疾病防治方面具有独特优势。

蛭龙活血通瘀胶囊是本院杨思进教授结合中医药理论及多年临床经验总结研发的院内制剂，由黄芪、水蛭、地龙、大血藤、桂枝组成，具有化痰通络、益气活血的功效。前期工作表明其具有良好的抗AS作用[5]，但对蛭龙活血通瘀胶囊拆方组分防治AS 的研究尚未涉及。本实验通过制备大鼠AS 模型，观察了蛭龙活血通瘀胶囊及其拆方对AS大鼠血脂四项、主动脉病理形态学及内膜厚度的影响，筛选出其抗AS的主要药味，精简组方，探讨其作用机制，并为该药临床广泛应用于防治AS提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级健康雄性SD 大鼠110 只，体重（200 ±10）g，西南医科大学实验中心提供。所有实验操作均获得西南医科大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 实验药物

蛭龙活血通瘀胶囊组成（免煎颗粒）：黄芪（每袋装1.1 g）、桂枝（每袋装0.3 g）、大血藤（每袋装0.6 g）、地龙（每袋装1.0 g）、水蛭（每袋装0.3 g），均购自四川新绿色药业科技公司。阿托伐他汀钙10 mg/片，维生素D3注射液7.5 mg/mL，丙硫氧嘧啶50 mg/片等。

1.3 实验试剂与耗材

胆酸钠、胆固醇、卵清蛋白、牛血清蛋白、多聚甲醛、无菌注射器、灌胃针、手套、口罩、生理盐水等。

1.4 实验仪器

高温低速离心机、正置荧光显微镜、Leica 切片机、生物组织包埋机、全自动生化分析仪、病理图像采集成像系统等。

1.5 实验方法

1.5.1 正交设计分组 本实验主要研究蛭龙活血通瘀胶囊中黄芪（A）、桂枝（B）、大血藤（C）、地龙（D）、水蛭（E）这五味组成药物，拆方组用这五个因素，取“用药”“不用药”水平，分别以“1”和“0”表示，采用正交设计表设计出拆方1～7号方（表1）。

表1 蛭龙活血通瘀胶囊正交设计表

将适应性喂养1周后的健康清洁级SD大鼠110只随机分为空白组、模型组、阿托伐他汀组、全方组、拆方1～7 号组，每组10 只，每笼5 只。

1.5.2 建立模型 参照张安邦等[6]探索的复合方法制备SD大鼠AS模型。各组大鼠饲养120 d后取材。

1.5.3 药物干预 造模60 d后，药物干预组予以不同药物干预，各药物等效剂量换算按照原方体重为60 kg 成人剂量的6.17 倍的计算比例[7]，各组按照10 mL·kg-1·d-1的量予以悬液[8]，每日灌服1次，持续60 d。

1.5.4 取材及检测指标 末次给药后，采集腹主动脉约5 mL 血液，于离心机中以3000 rpm/min 离心10 min，分离血清。生化分析法检测TC、甘油三酯（tri⁃glyceride，TG）、LDL-C、HDL-C的含量。

取血后，剪取约2 cm 长的胸主动脉，清理附着组织，生理盐水冲洗后用4%甲醛固定24 h，制作病理切片，经HE 染色后，在光镜下观察胸主动脉形态学变化，随机选取四个视野，用IPP 6.0 图像分析系统测量胸主动脉内膜厚度（IT）。

1.5.5 统计学分析 使用IBM SPSS 21.0统计软件进行分析，本实验所有计量资料均以均数±标准差（）表示，正交试验结果通过直观和方差分析法进行分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 药物对AS大鼠血清血脂四项的影响

与空白组相比，模型组大鼠血清TG、TC、LDL-C值明显升高，HDL-C 值明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，除拆6、7号组外，余各药物组的大鼠血清TG、TC、LDL-C值均明显降低，HDL-C 值均明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），模型组与拆6、7 号组相比血清TG、TC、HDL-C、LDL-C 值差异无统计学意义（P ＞0.05）；蛭龙活血通瘀胶囊全方组（即全方组）与各拆方组相比，血清TG、TC、LDL-C值均明显降低，HDL-C值明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；拆2 号组与余各拆方组相比，血清TG、TC、LDL-C值均明显降低，HDL-C 值明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；同理，拆1 号组与剩余各拆方组相比，大鼠血清TG、TC、LDL-C 值均明显降低，HDL-C 值明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；拆3 号组与拆4、5号组大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C值无明显差异（P ＞0.05），而拆3号组与拆6、7号组相比，其大鼠血清TG、TC、LDL-C 值均明显降低，HDL-C 值明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；拆6 号组与拆7 号组相比较，血清TG、TC、HDL-C、LDL-C 值无明显差异（P ＞0.05）。全方组与阿托伐他汀组相比，血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 值无明显差异（P ＞0.05）；各拆方组与阿托伐他汀组相比，大鼠血清TG、TC、LDL-C值均明显升高，HDL-C值均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2、3。

表2 各组大鼠血清TC、TG值的比较（n=10，mmol/L，）

表2 各组大鼠血清TC、TG值的比较（n=10，mmol/L，）

注：a 与空白组比较P＜0.05；b 与模型组比较P＜0.05；c与阿托伐他汀组比较P＜0.05；d与全方组比较P＜0.05；e与拆1号组比较P＜0.05；f与拆2号组比较P＜0.05；g与拆3号组比较P＜0.05；h与拆4号组比较P＜0.05；i与拆5号组比较P＜0.05；j与拆6 号组比较P＜0.05；k与拆7号组比较P＜0.05

表3 各组大鼠血清LDL-C、HDL-C值的比较（n=10，mmol/L，）

表3 各组大鼠血清LDL-C、HDL-C值的比较（n=10，mmol/L，）

注：a与空白组比较P＜0.05；b与模型组比较P＜0.05；c与阿托伐他汀组比较P＜0.05；d与全方组比较P＜0.05；e与拆1号组比较P＜0.05；f与拆2号组比较P＜0.05；g与拆3号组比较P＜0.05；h 与拆4 号组比较P＜0.05；i 与拆5 号组比较P＜0.05；j 与拆6 号组比较比较P＜0.05；k 与拆7 号组比较P＜0.05

2.2 药物对AS 大鼠血清血脂四项影响的正交实验结果

取各组大鼠TG、TC、HDL-C、LDL-C 值的平均值，根据正交设计表分别计算各列K 值和R 值，K 值表示各药物组分采用或不采用时血脂指标的平均值，R 值的大小反应各药物成分对血清TG、TC、HDL-C、LDL-C值影响的大小。

根据计算血清TC、LDL-C 的R 值，TC：R黄芪为1.44，R桂枝为0.67，R大血藤为0.2，R地龙为0.65，R水蛭为0.65；LDL-C：R黄芪为0.83，R桂枝为0.47，R大血藤为0.08，R地龙为0.31，R水蛭为0.31，排列出各因素对血清TC及LDL-C 值影响的大小顺序均是黄芪＞桂枝＞地龙=水蛭＞大血藤，可见蛭龙活血通瘀胶囊中发挥降低血清TC、LDL-C 作用的药味主要是黄芪、地龙、水蛭、桂枝。据方差结果显示证实这一结果：全方中黄芪明显降低血清TC、LDL-C 值（P＜0.01），桂枝、水蛭、地龙降低血清TC、LDL-C 值作用较黄芪弱（P＜0.05），而大血藤无明显降低血清TC、LDL-C 值作用（P ＞0.05）。

同理计算血清TG 的R 值，R黄芪为0.83，R桂枝为0.39，R大血藤为0.09，R地龙为0.25，R水蛭为0.29，排列出各因素对血清TG 值影响的大小顺序是黄芪＞桂枝＞水蛭＞地龙＞大血藤，可见蛭龙活血通瘀胶囊中发挥降低血清TG作用的药味主要是黄芪、水蛭、地龙、桂枝。据方差结果显示证实这一结果：全方中黄芪明显降低血清TG 值（P＜0.01），桂枝、水蛭、地龙降低血清TG 值作用较黄芪弱（P＜0.05），而大血藤无明显降低血清TG值作用（P ＞0.05）。

同理计算血清HDL-C 的R 值，R黄芪为0.38，R桂枝为0.22，R大血藤为0.03，R地龙为0.2，R水蛭为0.22，排列出各因素对血清HDL-C 值影响的大小顺序是黄芪＞桂枝=水蛭＞地龙＞大血藤，可见蛭龙活血通瘀胶囊中发挥升高血清HDL-C作用的药味主要是黄芪、水蛭、地龙、桂枝。据方差结果显示证实这一结果：全方中黄芪、桂枝、地龙、水蛭明显升高血清HDL-C 值（P＜0.01），而大血藤无明显升高血清HDL-C 值作用（P ＞0.05）。

2.3 药物对AS大鼠胸主动脉形态学的影响

观察光镜下组织切片，空白组：正常主动脉血管壁，内膜无脂质沉积，各层结构清晰，少量平滑肌纤维及胶原纤维穿插其中，细胞排列正常，弹力纤维分布均匀，无泡沫细胞及纤维化等病理改变。模型组：动脉血管壁凹凸不平，内膜增厚、水肿向腔内凸起，内皮下可见大量泡沫细胞及脂质沉积，少许炎性细胞浸润，平滑肌萎缩，排列紊乱，中膜部分细胞结构消失，弹力纤维断裂，外膜可见少许结缔组织增生，形成典型的动脉粥样硬化斑块。与空白组比较，模型组的AS 病变明显。除拆方6 号组、拆方7 号组外，各药物组的病变程度较模型组轻，能不同程度的抑制AS 进展，保护血管内皮结构，其作用主要表现在减少炎性因子生成，抑制泡沫细胞的形成、聚集及脂质沉积，保护平滑肌细胞正常结构，抑制纤维化等。其中对胸主动脉形态学改变保护作用最佳的药物组是阿托伐他汀组和全方组，而拆方6 号组、拆方7 号组对大鼠胸主动脉形态学保护作用不明显，且拆方2号组优于余各拆方组。（见图1）

图1 各组大鼠胸主动脉病理形态学结果（HE染色，× 400）

2.4 药物对AS大鼠胸主动脉内膜厚度的影响

2.4.1 各组大鼠胸主动脉内膜厚度的比较 各组大鼠胸主动脉内膜厚度用图像分析仪检测，模型组较空白组内膜增厚明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）；除拆6、7 号组之外的其他药物干预组比模型组内膜明显变薄，差异具有统计学意义（P＜0.05）；拆6、7号组与模型组相比内膜厚度无明显差异（P ＞0.05）。与相比，各拆方组内膜较阿托伐他汀组明显增厚，差异具有统计学意义（P＜0.05）。阿托伐他汀组与全方组内膜厚度差异无统计学意义（P ＞0.05）。与全方组相比，各拆方组内膜明显增厚，差异具有统计学意义（P＜0.05）；拆方组中，拆2 号组内膜厚度较其他拆方组明显变薄，差异具有统计学意义（P＜0.05）。拆1号组较拆3、6、7号组内膜明显变薄，差异具有统计学意义（P＜0.05），拆1 号组与拆4、5 号组的内膜厚度无明显差异（P ＞0.05）。拆3号组的内膜厚度较拆6、7 号组明显变薄，差异具有统计学意义（P＜0.05）；拆6 号组和拆7 号组之间差异无统计学意义（P ＞0.05）。（见表4，图2）

图2 各组大鼠胸主动脉内膜厚度比较（，μm）

表4 各组大鼠胸主动脉内膜厚度比较（n=10，μm，）

表4 各组大鼠胸主动脉内膜厚度比较（n=10，μm，）

注：a与空白组比较P＜0.05；b与模型组比较P＜0.05；c与阿托伐他汀组比较P＜0.05；d与全方组比较P＜0.05；e与拆方1 号组比较P＜0.05；f 与拆方2 号组比较P＜0.05；g 与拆方3号组比较P＜0.05；h与拆4号组比较P＜0.05；i与拆5号组比较P＜0.05；j 与拆6 比较P＜0.05；k 与拆7 比较P＜0.05

2.4.2 药物对大鼠胸主动脉内膜厚度影响的正交试验结果 取各组大鼠胸主动脉内膜厚度的平均值分析，根据正交设计表计算各列K 值和R 值，K 值表示各药物组分采用或不采用时大鼠胸主动脉内膜厚度的平均值，R 值的大小表示各药物成分对大鼠胸主动脉内膜厚度影响的大小。

计算大鼠胸主动脉内膜厚度的R 值，R黄芪为11.48，R桂枝为8.10，R大血藤为2.8，R地龙为8.00，R水蛭为8.92，排列出各因素对大鼠胸主动脉内膜厚度值影响的大小顺序：黄芪＞水蛭＞桂枝＞地龙＞大血藤，可见蛭龙活血通瘀胶囊中黄芪、地龙、水蛭、桂枝发挥使大鼠胸主动脉内膜变薄作用。据方差结果显示证实这一结果：全方中黄芪、地龙、水蛭、桂枝有抑制大鼠胸主动脉内膜增厚作用（P＜0.05），桂枝、水蛭、地龙降低血清TG 值作用较黄芪弱（P＜0.05），而大血藤无此作用（P ＞0.05）。

3 讨论

研究证实[9]脂质代谢障碍是AS病变的基础，TC、TG 代谢紊乱与临床密切相关。TC 升高能聚集在血管壁逐步形成胆固醇结晶，刺激炎症因子生成诱发血管炎性反应，使血管内皮功能紊乱，促使AS发生[10]。许多研究[11]表明LDL 和HDL 的结构改变可能是TG升高致动脉粥样硬化作用的主要原因。LDL-C 增高是AS发生、发展的主要危险因素[12-13]，LDL在破损的血管内皮下被氧化形成氧化型LDL（Ox-LDL），经巨噬细胞吞噬后形成大量泡沫细胞，泡沫细胞聚集、融合构成动脉粥样硬化斑块的脂质核心，促进AS发生发展。研究表明[14]慢性炎症反应贯穿整个AS病理过程，而LDL是慢性炎症反应启动和维持的基本要素。HDL能将外周血管壁内的胆固醇转运至肝脏分解代谢，即胆固醇的逆转运，因此减少胆固醇沉积于血管壁，抑制脂质斑块形成，从而起到抗AS的作用[15]。已有大量证据表明提高血浆HDL，降低血浆TC、LDL-C可逆转AS 的发生[16]。故改善脂质代谢紊乱是防治动脉粥样硬化的重要措施。

血管内皮损伤是AS发生的始动环节，正常的动脉壁由腔面至外依次分为内膜、中膜和外膜三层。AS主要病理基础是血管内膜增厚，其特征性表现为局部的粥样斑块性增生。通过内膜厚度的比较在一定程度上反映各组大鼠胸主动脉动脉粥硬化程度的不同。

蛭龙活血通淤胶囊目前广泛应用于临床AS 的治疗。现代药理研究证实黄芪能明显清除氧自由基、改善微循环、抑制血小板黏附聚集，减少血栓形成，调节血脂，减少AS 的发生[17]；地龙具有抑制血小板聚集、促进血液流动、防止血栓形成和降血脂作用[18]；水蛭有降血脂和改善血液流变学作用[19]；桂枝也有抗血小板聚集、促进血液循环及明显的降血脂作用[20]；大血藤有抗炎、抗自由基、抑制血小板聚集等作用[21]。本研究结果显示，除拆6 号及7 号组外，与模型组相比余各药物组均能降低TC、TG、LDL-C，升高HDL-C含量，能不同程度的影响大鼠胸主动脉形态学改变，保护血管内皮损伤，其中以蛭龙活血通瘀胶囊全方组和阿托伐他汀组效果最佳，这说明蛭龙活血通瘀胶囊能通过改善脂质代谢紊乱和保护大鼠胸主动脉形态学改变而影响AS的发生发展。且在不考虑药物相互作用的情况下，黄芪、桂枝、水蛭、地龙在蛭龙活血通瘀胶囊抗AS效应中发挥主要作用，而大血藤在其中作用不明显。

4 结论

蛭龙活血通瘀胶囊全方及有效拆方组对大鼠胸主动脉形态都有不同程度保护作用，能降低TC、TG、LDL-C，升高HDL-C，改善脂质代谢，从而表现出抗AS效应。其中黄芪、地龙、桂枝、水蛭起主要抗AS作用，黄芪是核心药味，若不考虑药物间相互作用影响，大血藤可能无抗AS作用。