云浮市2016-2018年外环境禽流感病毒监测分析

李碧明 云浮市疾病预防控制中心（广东，云浮，527300）

禽流感是指由禽流感病毒引起的一种禽类传染病，可以引起禽类呼吸器官或全身性感染。根据病毒的外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性不同，禽流感病毒可分为16个HA亚型和9个NA亚型［1］。目前引起人类感染和发病的主要为H5、H7和H9这3种亚型，人感染禽流感主要是由于接触感染病毒的禽鸟及其分泌物和排泄物［2］。活禽交易市场是市民接触禽鸟等活禽的主要场所，是人感染H5N1、H7N9等禽源流感的高风险区域［3-4］。云浮市在2017年2月报告首例人感染H7N9本地病例，提示云浮市存在一定的禽流感疫情风险。文章对云浮市2016-2018年禽流感病毒监测结果进行分析，了解云浮市区的禽流感病毒分布状况，为人感染禽流感预防控制工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本采集

根据《广东省家禽鸟类市场环境样品禽流感病毒污染监测方案》要求，在2016-2018年选择云浮市5个县市区的城乡活禽交易市场、家禽规模养殖场等2类涉禽场所作为外环境监测点，每年11月至次年4月每月采集60份以上标本，其余月份每月采集20份标本，主要采集家禽粪便标本、笼具表面涂抹物、禽类饮水、清洗禽类的污水、宰杀或摆放禽肉案板表面的擦拭标本及其他标本（包括不明原因死亡家禽、野禽咽拭子和肛拭子）。采样液为病毒采样液（北京友康），24h内检测置于4℃冰箱保存，未能及时检测则置于－70℃保存。

1.2 检测方法

在Ⅱ级生物安全柜内对标本进行核酸提取，RNA提取采用磁珠法，核酸提取试剂盒为天隆核酸提取试剂盒。提取RNA后，采用实时荧光定量－聚合酶链反应（real-time PCR）方法进行甲型流感病毒核酸检测，对甲型流感病毒核酸阳性的标本进行H5、H7、H9亚型核酸检测，对H7亚型阳性的标本再进行N9亚型检测。real-time PCR仪为美国ABI7500 FAST，核酸检测试剂盒分别为：甲型流感病毒核酸检测试剂盒、禽流感病毒H5/H7/H9亚型三重核酸检测试剂盒、甲型流感N9基因检测试剂盒，均由深圳生科原生产。PCR反应体系配制：总体积25μl，包括PCR反应液：17μl；引物探针混合液：2μl；混合酶液：1μl。参数设置：50℃30min；95℃3min；95℃5s；55℃60s，45个循环。实验结果根据real-time PCR扩增曲线、Ct值判断。

1.3 统计方法

将有关数据录入EXCEL软件进行整理，通过Graph Pad Prism8.02软件进行统计分析，阳性率的比较采用One-way A nova，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 禽类市场环境不同亚型禽流感病毒的阳性率比较

共采集标本1765份，检出甲型流感病毒核酸阳性标本378份，平均阳性率为21.42%。2016-2018年甲型流感病毒核酸阳性率分别为：14.13%、29.13%、19.83%。各年甲型流感病毒核酸阳性率差别较大，其中2017年甲型流感病毒核酸阳性率最高。3年持续监测禽流感病毒不同亚型的污染状况，各病毒亚型监测情况见表1。病毒亚型阳性率存在显著性差别，（P<0.0001）其中H9亚型的检出率明显高于其他型别，为禽类市场环境标本禽流感病毒的主要病原体（见图1）。

图1 不同亚型禽流感病毒阳性率比较

表1 2016-2018年云浮市禽类市场外环境标本禽流感病毒监测结果

2.2 禽流感病毒亚型的时间分布

监测H5、H7、H9亚型在2016年1月至2018年12月的时间分布显示，在各监测时间点，H9亚型阳性率均高于H5、H7亚型，其中2018年8月达45.00%。在2016年5、7、11、12月、2017年的1-5月和2018年1月检出H7亚型，进一步的分型显示均为H7N9亚型，阳性率最高为21.67%。H5亚型检出率总体上低于H9亚型，高于H7亚型（见图2）。

图2 2016-2018年云浮市禽类市场禽流感病毒月监测结果

2.3 不同标本类型的禽流感病毒污染状况

1765份标本中，清洗禽类的污水标本Flu A阳性率为32.31%（95/294），宰杀或摆放禽肉案板表面的擦拭标本Flu A核酸阳性率为32.97%（91/276）；其余4种标本类型Flu A核酸阳性率分别为：粪便14.08%（86/611）；笼具表面擦拭标本19.60%（100/510）；禽类饮水标本4.2%（2/48）；其他标本15.40%（4/26）。6种标本类型阳性率比较有统计学意义（P值<0.05）。清洗禽类的污水标本和宰杀或摆放禽肉案板表面的擦拭标本的Flu A核酸阳性率明显高于其他标本类型，提示清洗禽类的污水和案板表面是禽流感病毒污染的主要媒介（见图3）。

图3 不同类型标本的禽流感病毒核酸阳性率比较

3 讨论

对云浮市2016-2018年的禽流感病原监测数据进行分析，发现云浮市禽类市场外环境禽流感病毒的阳性率为21.4%，广东省广州［1］、珠海［5］、惠州［6］等珠三角地市的外环境禽流感病毒阳性率均为40%以上。云浮市禽类市场外环境禽流感病毒污染程度较低，这可能与云浮市县市区多为城乡结合型城镇，城区禽类市场活禽多来自本地，与其他城市活禽交易不活跃有关。全年均能监测到禽流感病毒，提示禽流感病毒广泛分布于云浮市禽类市场外环境中，需要加强市场外环境禽流感病原学监测，分析发展趋势变化。

针对禽流感病毒亚型分析发现，H9亚型的污染比例远高于其他型别，与珠三角其他地市的研究结果类似，均提示活禽市场外环境禽流感病毒污染源主要以H9亚型为主［7-8］。有研究表明，携带病毒的禽类是人感染禽流感的主要传染源［5，9］，外环境H7N9亚型在2017年1-5月出现流行高峰，提示人群在活禽交易市场感染禽流感病毒的风险较高，需加强市场休市、终末消毒等有关措施落实。云浮市在2017年2月报告首例人感染H7N9本地病例，这可能与外环境H7N9亚型在2017年1-5月出现流行相关。采集的6种不同类型的样本中均检出禽流感病毒，其中粪便标本、笼具表面擦拭标本病毒检出率相对较低，与有关研究结果［10］一致，可能与禽流感病毒为呼吸道传播病毒，禽类粪便标本病毒载量较低，且粪便标本不利于禽流感病毒的长期保存有关［11］。而潮湿的环境有利于禽流感病毒存活较长的时间［12］，因此，在开展外环境监测时，应采集更容易被病毒污染的屠宰用具及污水标本，从而提高监测的敏感性。

综上所述，在云浮市禽类市场进行禽流感病原学监测具有积极意义，可为云浮市人感染禽流感病毒提供预警和指导有关控制措施实行。政府部门应在冬春季节来临前，针对暴露于城乡活禽市场和家禽屠宰厂、从事活禽宰杀工作的高危人群和鸭类养殖区域开展重点监测和宣传教育。