基于网络药理学探究三七-扶芳藤药对治疗心力衰竭的作用机制

莫霄云，杨 朔，黄 琛，何贵新

三七为五加科人参属植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]的干燥根和根茎，为广西地道药材[1]。《玉楸药解》载 “和营止血，通脉行瘀，行瘀血而敛新血”[2]。三七具有散瘀止血、消肿定痛的功效。扶芳藤[Euonymus fortunei(Turcz.)Hand.-Mazz]为卫矛科常绿藤本灌木，又名卫生草、岩青藤、岩青杠等，《本草拾遗》记载：“扶芳藤，无毒，味苦，小温，主一切气，一切血，一切冷，去百病……久服延年”[3]。扶芳藤具有益气血、补肝肾、舒筋活络、止血化瘀等功效。现代药理研究表明，三七、扶芳藤具有抗氧化、抗血栓、心脏保护、抗肿瘤、神经保护、抗内毒素等多种药理作用，其对心血管系统、神经系统及血液系统等均有良好的临床治疗效果[4-5]。网络药理学将生物学网络与药物作用网络整合，探究疾病及药物的相互作用机制，与复杂疾病的治疗理念相吻合，已被广泛用于中药潜在活性成分和作用靶点的预测及中药作用机制的阐述方面[6]。本研究以三七-扶芳藤药对为研究对象，建立三七-扶芳藤“成分-靶点-心力衰竭”复杂网络，从网络药理学角度阐释三七-扶芳藤治疗心力衰竭的有效成分及其关键靶点，揭示三七-扶芳藤的药效物质基础和治疗心力衰竭的疗效机制。

1 资料与方法

1.1 检索数据库 检索数据库包括：中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systema pharmacolgy databas and analysis platform，TCMSP)(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，Uniprot数据库(https：// www.uniprot.org/)，Swiss Target Prediction数据库(http：//www.swisstargetprediction.ch/)，Gene Cards数据库(https：// www.genecards.org/)，STRING数据库(https：//string-db.org/)，Venny2.1在线软件作图工具平台(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，CytoScape3.7.1软件，R3.6.0软件等。

1.2 药物作用靶点筛选 在TCMSP数据库中检索三七、扶芳藤，并结合文献收集三七-扶芳藤药对内各药物的化学成分及靶点信息，使用Uniprot数据库，将药物的靶点名称进行矫正统一，并使用Swiss Target Prediction数据库对药物的靶点信息进行补充。

1.3 疾病作用靶点筛选 使用GeneCards数据库以“heart failure”为关键词进行检索，获得疾病作用靶点。

1.4 药物-疾病共同靶点的筛选 在Venny2.1在线软件作图工具平台上分别录入三七-扶芳藤与心力衰竭的靶点，绘制韦恩图，得到药物与疾病的共同靶点。

1.5 网络模型的构建及分析 使用CytoScape3.7.1软件，构建“药物-成分-疾病-靶点”相互作用网络图，使用Network Analyzer功能对中药复方的主要活性成分进行分析。

1.6 构建蛋白相互作用关系网络图 将上述药物-疾病共同靶点输入到STRING数据库中进行检索，选取minimum required interaction score>0.4，构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络，并根据蛋白之间的关联度进行排序。

1.7 通路富集分析 在R软件安装Bioconductor软件包“org.Hs.eg.db”并运行，将药物-疾病共同靶点转换成entrezID。然后在R软件安装“clusterProfiler”包，根据已转换的entrezID，以P<0.05，Q<0.05进行关键靶基因本体(gene ontology，GO)注释及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)功能富集分析，并将结果以条形图形式输出。

2 结 果

2.1 三七-扶芳藤药对有效活性成分及靶点筛选 在TCMSP数据库中设定生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18，对2味药物的有效成分进行筛选，结合文献补充纳入三七[7]中的人参皂苷rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1，扶芳藤[8]中的卫矛醇、儿茶素、木栓酮、没食子酸。去重后共得到有效活性成分16个，分别包括三七12个、扶芳藤4个。详见表1、表2。将活性成分对应的靶点输入UniProt数据库，并使用Swiss Target Prediction数据库对靶点信息进行补充，删除去重，共筛选出345个药物靶点(其中三七187个，扶芳藤193个)。

表1 三七-扶芳藤药对中药物-成分-靶标基本信息

表2 三七-扶芳藤药对的有效活性成分信息

2.2 药物-疾病共同靶点的获取 以“heart failure”为关键词在GeneCards数据库进行检索，去重后共获得相关靶点1 0961个，取排名居前2 000位作为研究靶点。在Venny2.1在线软件作图工具平台上输入345个药物靶点、2 000个疾病靶点，绘制韦恩图，两者取交集后获得药物-疾病共同靶点148个。详见图1。

图1 三七-扶芳藤与心力衰竭靶点韦恩图

2.3 药物-成分-靶点-疾病网络图的构建 将三七-扶芳藤药对中16个潜在活性成分与148个药物-疾病共同靶点输入Cytoscape软件中，绘制出药物-成分-靶点-疾病相互作用的网络图。详见图2。图中紫色代表药物，蓝色代表中药复方中的15种活性成分(1个活性成分靶点与疾病靶点无交集，予删除)，绿色代表包括环加氧酶1(PTGS1)、基质金属蛋白酶3(MMP-3)、信号传导及转录激活蛋白(STAT1)、血管内皮生长因子(VEGFA)、蛋白激酶(AKT1)、C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、白介素-6(IL-6)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、低聚果糖(FOS)在内的148个共同靶点，红色代表疾病。

图2 药物-成分-靶点-疾病相互作用的网络图

2.4 蛋白相关作用关系网络图的构建 在STRING数据库中录入上述148个共同靶点，分析得到蛋白相互作用的PPI网络。详见图3。每条边代表蛋白与蛋白之间的相互作用关系，线条越多代表关联度越大，得到PPI图中包括IL-6、AKT1、VEGFA、胱天蛋白酶3(CASP3)、表皮生长因子(EGF)、表皮生长因子受体(EGFR)等排名居前30位的靶点排序。详见图4。从图中可以看出，148个药物-疾病靶点可能是整个网络中的核心，三七-扶芳藤药对可能是通过这些靶点对心力衰竭起作用。

图3 靶点相互作用PPI图

图4 PPI图中的靶点排序(排名前30位)

2.5 靶点生物功能及通路分析 将148个共同靶点经R语言运行后GO分析选取生物学过程、细胞组分及分子功能3部分。GO结果显示，交集基因集合共富集至2 243条生物学过程通路中(见图5)，其中，富集基因数>10个(富集度>20%)为428条，主要与对细胞外刺激的反应、对脂多糖反应的营养水平的反应、对类固醇激素的反应、活性氧代谢过程、体液水平的调节相关等；交集基因集合共富集至73条细胞组分表达过程中(见图6)，其中，富集基因数目>10个(富集度>20%)为24条，主要与膜筏、膜微区、膜区域、卡维多拉、质膜筏、囊泡腔细胞外基质、细胞质囊泡腔分泌颗粒腔等有关；交集基因集合共富集至 156个与分子功能相关的过程中(见图7)，其中，富集基因数目>10个(富集度>20%)为26项，主要与细胞因子受体结合、类固醇结合、内肽酶活性、辅因子结合、细胞因子活性、受体配体活性、丝氨酸水解酶活性等有关。

图5 三七-扶芳藤药对GO富集分析的生物过程条形图

图6 三七-扶芳藤药对GO富集分析的细胞组分条形图

图7 三七-扶芳藤药对GO富集分析的分子功能条形图

将148个共同靶点经R语言运行后共得到144条KEGG通路，前30条的结果形成KEGG功能富集的条形图，P代表富集的显著性，颜色越红则显著性越高。结果显示共同靶点主要富集于如AGE-RAGE通路、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)通路、两面神激酶-信号传导及转录激活蛋白(JAK-STAT)通路、胞内磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)通路等。详见图8。

图8 三七-扶芳藤药对治疗心力衰竭的KEGG富集分析

3 讨 论

本研究基于网络药理学手段，通过对三七-扶芳藤药对进行成分、靶点与疾病的生物信息学综合网络构建，探究三七-扶芳藤药对治疗心力衰竭的整体机制，呈现出中药治疗的多成分、多靶点、整合调节的特点，并进一步通过网络分析揭示具核心作用通路。

通过整合网络药理学分析和实验室报道，发现三七-扶芳藤药对的主要化学成分包含人参皂苷Rb1(Gs-Rb1)、槲皮素、β-谷甾醇、儿茶素、没食子酸等[7-8]，部分关键化合物分子具有高度的中心性，并且应用于心血管领域的研究中。相关研究表明，人参皂苷Rb1可在AMPK信号级联介导下减轻心肌细胞的缺血缺氧损伤[9]。李龙飞等[10]研究发现，人参皂苷Rb1可以阻止阿霉素引起的心肌细胞活力降低，还能够减少阿霉素诱导的心肌细胞自噬，人参皂苷Rb1对阿霉素诱导心肌细胞死亡的保护作用可能是通过调节心肌细胞自噬而实现的。槲皮素(quercetin)具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等广泛生理活性[11]，已被证明可以减少动脉粥样硬化病变的形成[12]。β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、降低胆固醇、抗肿瘤等功效，研究表明，β-谷甾醇可以降低胆固醇小肠吸收，还能通过抑制胆固醇合成酶(HMG-CoA)的表达，减少胆固醇的体内合成，是治疗高胆固醇血症的有效药剂[13-15]。研究表明，儿茶素可缓解大鼠心力衰竭，其作用机制可能通过竞争磷酸二酯酶(PEDs)的活性位点，使 PEDs 的催化活性降低而产生催化延迟效应，而且可以抑制心肌细胞凋亡，从而起到缓解心力衰竭的作用[16]。卜丽梅等[17]研究表明，没食子酸可明显降低血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)以及天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平，缩小心肌梗死区范围，对大鼠实验性缺血/再灌注损伤具有保护作用，其机制可能与没食子酸分别下调促凋亡基因Bax和上调抑制凋亡基因Bcl-2的蛋白表达降低心肌细胞的凋亡有关。这些关键化合物在炎症反应、抗氧化、改善血流灌注、调节血管内皮功能、抑制心肌细胞凋亡及调节心肌细胞自噬等方面均有一定的作用，与三七-扶芳藤药对前期功效的研究结论有一定契合性。现代医学认为，心室重构是导致心力衰竭不断进展的生理病理基础[18]。心肌细胞肥大、炎症反应和心脏纤维化是心室重构相关的主要病理变化，心室重构引起心肌细胞自噬水平变化，提高自噬可以抑制心肌重构及心肌肥厚，对自噬信号通路及调控机制的研究将是治疗心力衰竭非常有前景的策略。

本研究通过分析筛选出三七-扶芳藤药对的有效活性成分、作用靶点、信号通路，构建与心力衰竭相关的PPI网络，用以分析三七-扶芳藤药对治疗心力衰竭的潜在作用机制。根据药物-疾病-成分网络图，三七-扶芳藤药对各成分通过包括PTGS1、MMP-3、STAT1、VEGFA、AKT1、CRP、IL-6、MMP-9、FOS等多种靶点协同作用，最终达到治疗心力衰竭的作用。贾彩霞等[19]通过网络药理学分析发现PTGS1与炎症、细胞凋亡相关，能够降低血清促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1(IL-1)的水平，明显改善心功能。孙奇林等[20]研究发现MMP-3属于细胞外基质金属蛋白酶，通过药物干预降低MMP-3的表达达到延缓心肌纤维化的作用。IL-6可通过抑制一氧化氮(NO)合成能力直接影响心脏的收缩能力。马伟利等[21]研究发现，通过药物降低IL-6水平可提高心肌收缩力，改善心功能，减轻心脏的氧化应激反应，延缓心室重构进程，从而有效治疗心力衰竭。研究表明，VEGFA对血管内皮具有保护作用[22]，VEGFA为冠心病、高血压、动脉粥样硬化治疗的新方案，VEGFA可通过调节大鼠的自噬水平，从而改善心功能[23]。MMP-9可促进Ⅰ型胶原水平(ICTP)降解，致使室壁压力增加、室壁变薄，心肌坏死致使其正常张力丧失，在室壁压力下心肌重新排列，最终导致心室重构[24]。

通过KEGG富集分析，三七-扶芳藤药对可能通过AGE-RAGE通路、AMPK通路、JAK-STAT通路、PI3K-AKT通路等多条通路发挥作用。AMPK是细胞的“代谢和能量感受器”[25]，AMPK 介导的信号级联反应是调节自噬的重要通路之一，AMPK 可感知细胞能量状态并调节能量稳态，通过线粒体自噬保护心肌细胞免受缺氧诱导的损伤[26]。自噬在能量代谢和蛋白质质量控制中起关键作用，且已发现其在病理状态下有益于心脏功能的恢复[27]。人参皂苷Rb1可能通过 AMPK 信号通路介导缺氧诱导的自噬作用进而调控缺氧心肌细胞的耐缺氧能力[9]。发生心力衰竭或心律失常时，AMPK 的表达在心脏代谢功能障碍中发挥重要作用[28]。研究表明，JAK-STAT通路能够调节细胞增殖、分化、炎症和凋亡[29]；曾勇等[30]研究发现中药可以通过抑制JAK-STAT通路的激活，减轻细胞凋亡，改善心功能。PI3K-AKT信号通路也对心肌细胞凋亡具有抑制作用；王萌等[31]发现激活PI3K/AKT信号转导通路，可以抑制心肌细胞凋亡，保护心肌细胞，抑制心室重构，控制心力衰竭的进展。

网络药理学是基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络综合考察药物对疾病网络的干预与影响，提示中药相关药理作用靶点、筛选中药有效靶成分可大大减少实验工作量，降低重要新药开发及研究的风险，有助于加速中药现代化及源于中药的创新药物发现[32]。中药对心力衰竭自噬的调控作用可能为促进，也可能为抑制，中药治疗疾病的机制是复杂交互的网络而并非单独起作用，因其多成分、多靶点、多途径的作用特点，调控细胞自噬机制复杂，可能涉及多条通路、多个靶蛋白。中药的抗病机制有待丰富，有关中药调控自噬的物质基础及机制也有待更深入的研究。随着自噬相关机制进一步研究，中药对自噬的调控有望成为治疗心力衰竭的新思路和新途径。本研究初步预测了三七-扶芳藤药对治疗心力衰竭的基本药理基础及功效机制，与现代临床用药规律契合，为下一步深入验证奠定了良好理论基础。