七氟烷预处理减轻体外循环心肌缺血再灌注损伤的作用机制

蒋 伟，王晓娟，梁 姣，吴 韬，谢东玮，曹兴华

体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)是广泛用于心脏外科手术的技术，通过特殊装置及人工管道将静脉血引流至体外并进行气体交换及特殊处理，而后输回动脉系统，能够保证心脏直视手术顺利完成。但是，CPB能够使心肌经历缺血及再灌注的过程，缺血再灌注会造成心肌损伤，增加术后心血管不良事件的发生风险[1-2]。如何减轻CPB后心肌缺血再灌注损伤一直是心胸外科的研究热点。七氟烷是一种新型的吸入型麻醉药物，使用七氟烷进行预处理能够减轻心肌缺血再灌注损伤。已有多项动物实验证实，七氟烷能够通过抑制炎症和氧化应激减轻脑组织缺血再灌注损伤[3-4]，但七氟烷预处理减轻体外循环过程中心肌缺血再灌注损伤的作用是否与抑制炎症和氧化应激有关报道较少。本研究探讨七氟烷预处理减轻体外循环心肌缺血再灌注损伤的作用机制。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年1月—2018年12月在我院接受择期心脏瓣膜置换术的病人120例作为研究对象，入组标准：①符合心脏瓣膜疾病诊断标准及CPB下瓣膜置换术的指证；②心功能Ⅰ级～Ⅲ级；③美国麻醉医师协会(ASA)分级Ⅰ级或Ⅱ级；④获得病人知情同意。排除标准：①合并高血压、糖尿病、冠心病；②合并感染性疾病、自身免疫性疾病；③肝、肾、肺功能不全；④既往有手术病史。采用随机数字表法分为预处理组与对照组，每组60例。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 两组临床资料比较

1.2 方法

1.2.1 麻醉方法 病人进入手术室后，连接心电监护后静脉输注地塞米松磷酸钠注射液10 mg，依次给予咪达唑仑0.1 mg/kg、依托咪酯0.2～0.4 mg/kg、舒芬太尼0.2～0.4 μg/kg、罗库溴铵0.8～1.0 mg/kg静脉推注以完成麻醉诱导，气管插管后进行麻醉维持：咪达唑仑0.05～0.10 mg/(kg·h)、舒芬太尼0.5～1.0 μg/(kg·h)、罗库溴铵0.1～0.5 mg/(kg·h)、右美托咪定0.5～1.0 μg/(kg·h)持续泵注。预处理组在麻醉诱导及气管插管完成后给予2%～5%的七氟烷吸入，氧流量4 L/min，调整七氟烷吸入浓度并使CETSev达到1 MAC并维持20 min，关闭七氟烷并洗脱10 min；对照组在麻醉诱导及气管插管完成后不给予其他特殊处理。

1.2.2 样本收集方法 麻醉诱导前(T0)、CPB前即刻(T1)、CPB后即刻(T2)、CPB后24 h(T3)，分别采集肘静脉血3 mL，3 000 r/min离心分离血清后，-80 ℃保存待测。T1和T2时，采集右心耳组织少量，预冷的生理盐水清洗残留血液后液氮冷冻30 min，放置在-80 ℃保存待测。

1.2.3 血清指标检测方法 取血清标本，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、晚期氧化蛋白产物(AOPP)的含量，采用硫代巴比妥酸(TBA)试剂盒检测丙二醛(MDA)含量，采用比色法试剂盒检测总抗氧化能力(T-AOC)。 ELISA试剂盒购自上海西唐生物公司，TBA试剂盒、比色法试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2.4 基因表达检测方法 取右心耳组织，采用RIPA裂解液分离组织中的蛋白样本，经BCA蛋白定量试剂盒检测总蛋白含量后取50 μg总蛋白与上样缓冲液混合，进行蛋白免疫印迹(Western Blot)，将蛋白样本加入预先配置好的聚丙烯酰胺凝胶的点样孔内，垂直电泳至上样缓冲液中的溴酚蓝条带移动至凝胶底部，而后进行电转膜，将蛋白样本从凝胶转移至NC膜，用5%脱脂牛奶在室温孵育NC膜2 h，用核因子-κB(NF-κB)、核因子-κB抑制因子(I-κB)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)2、NOX4的第一抗体在4 ℃孵育NC膜过夜；第2天，用第二抗体在室温孵育NC膜2 h后在凝胶成像仪中曝光得到蛋白条带，根据条带的灰度值计算蛋白表达量。RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒均购自上海碧云天公司，NF-κB、I-κB、NOX2、NOX4的单克隆抗体购自Abcam公司。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0软件进行数据分析。组内不同时间点的比较采用重复测量方差分析，两组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组围术期心肌酶含量比较 T0、T1时，两组血清LDH、CK、CK-MB含量比较差异无统计学意义(P>0.05)；与T0、T1比较，两组T2、T3时血清LDH、CK、CK-MB含量均明显升高(P<0.05)；与对照组比较，预处理组T2、T3时血清LDH、CK、CK-MB含量均明显降低(P<0.05)。详见表2。

表2 两组围术期LDH、CK、CK-MB含量比较(±s) 单位：U/L

2.2 两组炎症反应指标比较 T0、T1时，两组血清IL-1β、TNF-α、ICAM-1含量比较差异无统计学意义(P>0.05)；与T0、T1比较，两组T2、T3时血清IL-1β、TNF-α、ICAM-1含量均明显升高(P<0.05)；与对照组比较，预处理组T2、T3时血清IL-1β、TNF-α、ICAM-1含量均明显降低(P<0.05)。详见表3。T1时，两组右心耳组织中NF-κB、I-κB表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；T2时，预处理组右心耳组织中NF-κB表达量明显低于对照组，I-κB表达量明显高于对照组(P<0.05)。详见表4、图1。

表3 两组IL-1β、TNF-α、ICAM-1含量比较(±s)

表4 两组右心耳组织中NF-κB、I-κB表达量比较(±s)

图1 两组右心耳组织中NF-κB、I-κB的蛋白条带

2.3 两组氧化应激反应指标比较 T0、T1时，两组血清MDA、AOPP、T-AOC比较差异均无统计学意义(P>0.05)；与T0、T1时比较，两组T2、T3时血清MDA、AOPP含量均明显升高(P<0.05)，T-AOC明显降低(P<0.05)；与对照组比较，预处理组T2、T3时血清MDA、AOPP含量均明显降低(P<0.05)，T-AOC明显升高(P<0.05)。详见表5。T1时，两组右心耳组织中NOX2、NOX4表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；T2时，预处理组右心耳组织中NOX2、NOX4的表达量明显低于对照组(P<0.05)。详见表6、图2。

表5 两组MDA、AOPP、T-AOC比较(±s)

表6 两组右心耳组织中NOX2、NOX4表达量比较(±s)

图2 两组右心耳组织中NOX2、NOX4的蛋白条带

3 讨 论

CPB过程中心肌经历了缺血再灌注，缺血再灌注通过炎症反应、氧化应激反应、细胞凋亡等途径加剧心肌损伤，CPB后心肌缺血再灌注损伤会增加心血管事件发生风险，严重者会发生心源性猝死[5-6]。七氟烷是具有抗炎、抗氧化作用的吸入型麻醉药物，张亮等[7]的动物实验研究报道，七氟烷能够减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的程度；陈勤等[8]的临床研究报道，CPB前使用七氟烷预处理能够减轻心肌缺血再灌注损伤的程度，减少CPB后多种心肌酶的释放。本研究在心脏瓣膜置换术全身麻醉前进行了七氟烷预处理，通过观察围术期心肌酶的变化来反映心肌缺血再灌注损害的程度，与麻醉诱导前及CPB前即刻比较，两组CPB后即刻及CPB后24 h血清LDH、CK、CK-MB含量均明显升高，说明CPB后病人出现了明显的心肌损伤。预处理组CPB后即刻及CPB后24 h血清LDH、CK、CK-MB含量均明显低于对照组，这一结果与陈勤等[8]的研究结果一致，说明七氟烷预处理能够减轻CPB后心肌缺血再灌注的损伤。

炎症反应和氧化应激反应的激活是缺血再灌注引起心肌损伤的重要病理环节，一方面，炎症和氧化应激能够造成心肌细胞损害；另一方面，炎症和氧化应激也能激活细胞凋亡并造成心肌细胞损害。七氟烷的抗炎及抗氧化作用已经在脑缺血再灌注、肝缺血再灌注、脓毒症大鼠模型中被证实[9-11]，但该药物在CPB后心肌缺血再灌注过程中的抗炎及抗氧化作用尚未明确。在炎症反应激活的过程中，IL-1β、TNF-α、ICAM-1等细胞因子呈瀑布式释放，既能介导炎症的级联放大，也能作为评价炎症程度的标志物[12-13]。在氧化应激反应激活的过程中，氧自由基大量生成并攻击细胞中的脂质、蛋白质，引起细胞结构损伤的同时也导致氧化产物MDA及AOPP大量生成、T-AOC下降[14]。本研究通过血清炎症指标及氧化应激指标的变化来评价CPB前后心肌炎症及氧化应激损害的程度，与麻醉诱导前及CPB前即刻比较，两组CPB后即刻及CPB后24 h血清IL-1β、TNF-α、ICAM-1、MDA及AOPP均增多，而T-AOC均下降，说明CPB后炎症及氧化应激反应明显激活；预处理组CPB后即刻及CPB后24 h血清IL-1β、TNF-α、ICAM-1、MDA及AOPP均低于对照组，而T-AOC高于对照组，说明七氟烷预处理能够减轻CPB后的炎症及氧化应激反应，进而也提示七氟烷能够通过抗炎及抗氧化作用来减轻CPB后的心肌损伤。

以上血清心肌酶及炎症指标、氧化应激指标能够反映心肌损害的程度及炎症反应、氧化应激反应的变化，但均不是CPB前后心肌组织中炎症和氧化应激反应变化的直接证据。为了获得CPB前后心肌组织中炎症和氧化应激反应变化的直接证据，本研究在获得伦理委员会批准后采集了右心耳组织并通过Western Blot对炎症基因、氧化应激基因的表达进行了分析。NF-κB是调节炎症反应的核心转录因子，I-κB是其特异性抑制分子；在缺血缺氧、缺血再灌注、感染等病理因素的刺激下，I-κB的活性受到抑制，对NF-κB的抑制作用也被削弱，NF-κB活化后大量进入细胞核并启动IL-1β、TNF-α、ICAM-1等基因的表达并使炎症反应发生激活[15-16]。NOX2和NOX4是NOXs家族中在心肌内表达的主要成员，能够直接介导氧自由基的生成并使氧化应激反应发生激活[17]。本研究结果显示，预处理组CPB后即刻心肌中NF-κB、NOX2、NOX4的表达均明显低于对照组，I-κB的表达明显高于对照组，说明七氟烷预处理能够直接抑制心肌组织中炎症反应和氧化应激反应的激活。

综上所述，七氟烷预处理能够通过抗炎和抗氧化作用减轻CPB后的心肌缺血再灌注损伤，本研究的局限之处是仅仅通过临床数据来探究七氟烷的心肌保护作用，虽然通过心肌组织中基因表达的变化能够直接反映炎症和氧化应激的程度，但仍需要在今后的研究中进一步探讨七氟烷对心肌CPB后炎症及氧化应激的影响。