Neuropilin-1 表达对口腔鳞状细胞癌放疗敏感性的影响*

周 嵩 李腾飞 罗恒丹 胡志强

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)，是头颈部中最常见的恶性肿瘤[1,2]。局限性的口腔鳞癌的主要治疗包括手术、放疗、激光切除等。早期的口腔鳞癌如无颈部淋巴结转移，单独的手术或放射治疗均有较好成效；而对于晚期口腔鳞癌不适宜手术者，应采取放化疗联合或单纯放疗[3,4]。但不同个体对放疗的敏感性存在差异，因此，寻找预测口腔鳞癌放疗敏感性的有效生物标志物，对口腔鳞癌患者制定个性化放疗策略，实现个体化治疗具有重要的临床价值。本研究首先利用生物信息学方法，筛选出放疗敏感性口腔鳞癌组织与放疗耐受口腔鳞癌组织中的差异基因，其中Neuropilin-1(NRP-1)可能是影响口腔鳞癌放疗的关键基因，进一步从细胞学水平验证NRP-1 表达水平对口腔鳞癌放疗敏感性的影响。

1.资料方法

1.1 生物信息学挖掘口腔鳞癌放疗耐受相关基因 首先从GEO 数据库中，以“oral squamous cell carcinoma”，“Radiotherapy”，“Sensitivity”为关键词，筛选Organism 选择“Homo sapiens”，搜索人类口腔癌放疗敏感性相关数据集。利用R 统计学软件对下载的数据进行数据整理、数据过滤、注释、标准化。然后分析口腔鳞癌放疗敏感性细胞与放疗耐受细胞的差异表达基因。

1.2 联合TCGA 数据库，评估NRP-1 在口腔鳞癌中的表达情况 联合TCGA 数据库对该基因进行分析，评估该基因在口腔鳞癌的表达及其对预后的影响。利用R 软件对TCGA 数据库口腔鳞癌患者的数据进行分析，共筛选出46 例口腔鳞癌样本及26 例口腔组织样本作为对照。最后评估NRP-1 在口腔鳞癌的表达情况及对患者生存率的影响。

1.3 NRP-1 表达对人口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞增值的影响 野生型人口腔鳞状细胞癌Tca8113 细胞(WT-Tca8113)系购买于上海斯信生物科技有限公司。NRP-1 敲低Tca8113 细胞(KD-Tca8113)和NRP-1 过表达Tca8113 细胞(OE-Tca8113)由北京安必奇生物公司构建。细胞均使用含10%FBS(Gibco)和1%双抗(链霉素+青霉素)的DMEM 高糖培养基(Gibco)，在37℃，5%CO2条件下培养。Western Blot 试验和RT-qPCR检测三株细胞NRP-1 的表达量。

制备WT-Tca8113，KD-Tca8113 和OETca8113 单细胞悬液，分别在6 孔板中每孔接种1×105细胞，每组设6 个复孔，分别在12h 和24h后，胰酶消化后，用全自动细胞计数仪(Nexcelom)对每组进行活细胞计数。

1.4 NRP-1 表达对人口腔鳞状细胞癌Tca8113放疗敏感性的影响 将WT-Tca8113，KD-Tca8113和OE-Tca8113 分别接种于3 个6 孔板中，每孔接种1×105细胞。待细胞处于对数生长期时，更换新鲜培养液。各组细胞分别分为对照组，低剂量照射组和高剂量照射组。对照组细胞不做任何处理，低剂量照射组和高剂量照射组分别在室温下进行X 射线照射处理，照射剂量分别为2Gy(200cGy/ min)，8Gy(200cGy/ min)。照射结束后更换新鲜培养基。并置于培养箱继续培养24h。期间，对照组和照射组均每12h 更换一次新鲜培养基。胰酶消化后，用全自动细胞计数仪计算各组细胞存活率(细胞存活率=照射组活细胞数/ 对照组活细胞数)×100%。

1.5 统计学方法 实验数据均采用SPSS20.0软件进行统计分析，计量资料以平均值±标准差表示，多组间均数比较采用Kruskal-Wallis 秩和检验，再用LSD-t 检验进行两两比较。两组间比较采用t 检验。P﹤0.05 为有统计学意义。

2.结果

2.1 口腔鳞癌放疗耐受相关基因 共检索到1个与口腔鳞癌放疗敏感性相关的数据集GSE30784。R 统计学软件差异分析后，筛选出表达差异最大的20 个基因，其中10 个为口腔鳞癌放疗耐受组上调基因，10 个为口腔鳞癌放疗耐受下调基因，分别如表1 所示。其中，口腔鳞癌上调程度最高的分别为NRP-1，MMP11 和MMP1。

表1 口腔鳞癌放疗敏感与耐受组差异基因汇总表

2.2 NRP-1 在口腔鳞癌中的表达及其对预后的影响 TCGA 数据库中共收录46 例口腔鳞癌患者样本及26 例口腔组织样本。NRP-1 在46 例肿瘤样本及26 例正常对应口腔组织样本的表达量如图1A 所示，肿瘤组织的NRP-1 表达量明显较正常组织高，P﹤0.01，差异有统计学意义。此外，如图1B 所示，NRP-1 在口腔鳞癌各临床分期中的表达也具有差异，NRP-1 的表达量随着临床分期的增加而增加，各组差异有统计学意义，P﹤0.01。最后，以NRP-1 表达量中位数为界，将46 例口腔鳞癌患者分为NRP-1 高表达组和低表达组。生存分析(图1C)提示，NRP-1 低表达组患者的5 年生存率较高表达组高，Logrank 检验P=0.0272，差异有统计学意义。上述结果提示，在口腔鳞癌患者中，NRP-1 高表达对口腔鳞癌的发生、发展具有促进作用。且高表达NRP-1 的患者预后较差。

图1 NRP-1 在口腔鳞癌中的表达及其对预后的影响

2.3 NRP-1 表达对人口腔癌鳞状细胞癌Tca8113 细胞增值的影响 Western Blot 验证WTTca8113，KD-Tca8113 和OE-Tca8113 细 胞 的NRP-1 表达量，结果如图2A 所示，OE-Tca8113细胞中，NRP-1 表达量明显较WT-Tca8113 组高，而KD-Tca8113 细胞中，NRP-1 表达量明显较WT-Tca8113 低。三次独立Western Blot 试验的NRP-1 表达量如图2B 所示，KD-Tca8113 组和OE-Tca8113 组NRP-1 蛋白表达量均与WTTca8113 组有统计学差异。同样地，RT-qPCR 结果(图2C)也显示，KD-Tca8113 组和OE-Tca8113组NRP-1 的mRNA 表达量均与WT-Tca8113 组有统计学差异。

三组细胞的细胞增殖如图2D 所示，在12h时，WT-Tca8113，KD-Tca8113 和OE-Tca8113细胞数量约为0h 的3.2，2.2 和6.9 倍。其中OE-Tca8113 组与WT-Tca8113 组间差异有统计学意义(P﹤0.01)。24h 时，WT-Tca8113，KDTca8113 和OE-Tca8113 细胞数量约为0h 的9.5,6.0,和14.7 倍。KD-Tca8113 和OE-Tca8113 组与WT-Tca8113 组间均有统计学差异(P﹤0.05)。结果提示，KD-Tca8113 组细胞增殖率较WT-Tca8113低，而OE-Tca8113 组细胞增殖率较WT-Tca8113高。即NRP-1 表达量与Tca8113 细胞增殖呈正相关，NRP-1 促进Tca8113 细胞增殖。

图2 NRP-1 表达对人口腔癌鳞状细胞癌Tca8113 细胞增值的影响

2.4 NRP-1 表达对人口腔癌鳞状细胞癌Tca8113 放疗敏感性的影响 WT-Tca8113 组，KD-Tca8113 组和OE-Tca8113 组细胞分别给予2Gy 和8Gy 剂量的照射处理，光镜下可见高剂量射线组细胞数量及形态与低剂量组有明显差别(图3A)。此外，同剂量处理组间，WT-Tca8113 组，KD-Tca8113 组和OE-Tca8113 组的细胞数量及形态也不同。表现为：KD-Tca8113 组细胞数量较WT-Tca8113 组更少，且细胞形态不规则。而OE-Tca8113 组细胞细胞数量较WT-Tca8113 组多，细胞形态更规则。各处理组存活率如图3B 所示。低剂量和高剂量的照射均对各组细胞有一定的增殖抑制作用，且高剂量(8Gy)的照射较低剂量(2Gy)抑制作用更明显。低剂量(2Gy)和高剂量(8Gy)照射后，KD-Tca8113 组细胞活性均较WTTca8113 组低(P﹤0.05)；而OE-Tca8113 组胞活性均较WT-Tca8113 组高。结果提示，KD-Tca8113组细胞对射线敏感性较WT-Tca8113 高，而OETca8113 组细胞对射线敏感性较WT-Tca8113 低。即NRP-1 表达能提高Tca8113 细胞对射线的耐受。

图3 NRP-1 表达对人口腔癌鳞状细胞癌Tca8113 放疗敏感性的影响

3.讨论

Neuropilin-1(NRP-1)是细胞表面相对分子质量约为102KDa 的Ⅰ型跨膜糖蛋白，首次在欧洲蟾蜍的神经系统内被发现[7,8]。进一步研究发现，NRP-1 是Semaphorin3A(Sema3A)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor165，VEGF165)的共受体[9]。目前已有大量研究提示，NRP-1 在多种肿瘤组织中高表达，包括胃癌[10]、肝癌[11,12]、乳腺癌[13]、卵巢癌[14]、肾癌[15]等，且其表达与肿瘤的发生、发展与不良预后有关，是一个具有潜力的肿瘤靶向治疗靶点。且近年来，越来越多的研究提示，NRP-1 高表达可能与放化疗耐药相关[16-19]，陈昌贤等[16]利用生物信息学方法，发现在卵巢癌多耐药相关的miRNA 调控网络中，NRP-1 是卵巢癌多耐药基因中最重要的候选基因。徐芸[17]用NRP-1 单克隆抗体与化疗药物联用，在BGC-823 胃癌裸鼠模型中发现NRP-1 单克隆抗体阻滞NRP-1 后，能显著提高的化疗效果。结果提示，NRP-1 功能与胃癌化疗敏感性有关，而抑制NRP-1 功能后，化疗敏感性明显增高。沈耀川等[18]通过构建NRP-1 敲低的人舌鳞状细胞癌细胞，在细胞学水平验证NRP-1 高表达可促进细胞增殖、迁移。蒋萍[19]探讨了NRP-1 靶向肽EG3287对人口腔鳞状细胞癌BcaCD885 细胞株化疗敏感性的影响，发现EG3287 多肽能显著提高BcaCD885细胞的顺铂敏感性。上述研究均提示了NRP-1 的表达能影响肿瘤细胞的化疗敏感性。但是对于其中的分子机制和信号通路仍未有相关报道。

NRP-1 作为Sema3A 的共受体，目前已有数篇研究探究了Sema3A 和NRP-1 在口腔癌中的表达及其功能。张阳等[20]的研究发现，Sema3A 在舌癌组织和人舌癌SCC9 细胞株中表达量均很低，而作为Sema3A 共受体NRP-1 则在舌癌组织和人舌癌SCC9 细胞株均高表达。且外源性Sema3A 蛋白可明显抑制SCC9 细胞的增殖。张红闯等[21]在人舌癌组织和人舌癌Tca8113 细胞株中也发现相似的结果，Sema3A 在舌癌组织和舌癌细胞中表达量均很低，而NRP-1 在舌癌组织和舌癌细胞中表达量则呈高度表达。通常认为，Sema3A 可通过与VEGFA 竞争性结合NRP-1 而抑制肿瘤的血管形成，因此在肿瘤组织中，低表达Sema3A 和高表达NRP-1 往往提示预后不良[22]。

本研究通过生物信息学方法，筛选出NRP-1为口腔鳞状细胞癌放疗耐受的关键上调基因。进一步通过TCGA 数据库挖掘46 例口腔鳞癌患者样本及对应正常26 例对照样本，证实NRP-1 在口腔鳞癌中高表达(P﹤0.01)，且其表达量随着临床分期的增加而增加。此外，高表达NRP-1 的口腔癌患者预后较低表达的患者差(P=0.0272)。上述生物信息学结果提示NRP-1 与口腔癌患者的发生、发展和预后相关。

本研究进一步通过构建NRP-1 敲低和过表达人口腔癌鳞状细胞癌Tca8113 细胞株，从细胞水平初步探讨NRP-1 对口腔鳞状细胞癌Tca8113 细胞的影响。结果显示，在12h 时，WT-Tca8113，KD-Tca8113 和OE-Tca8113 细胞数量约为0h 的3.2，2.2 和6.9 倍。其中OE-Tca8113 组与WTTca8113 组间差异有统计学意义(P﹤0.01)。24h 时，WT-Tca8113，KD-Tca8113 和OE-Tca8113 细胞数量约为0h 的9.5,6.0,和14.7 倍。KD-Tca8113和OE-Tca8113 组与WT-Tca8113 组间均有统计学差异(P﹤0.05)。即敲低NRP-1 后，Tca8113 细胞的增殖能力减弱。反之，过表达NRP-1 后，Tca8113细胞的增殖能力增强。结果提示，NRP-1 的高表达能提高Tca8113 细胞的增殖能力。此外，本研究还初步探讨了NRP-1 表达与Tca8113 细胞对射线敏感性的影响。低剂量(2Gy)和高剂量(8Gy)照射后，KD-Tca8113 组细胞活性均较WT-Tca8113组低(P﹤0.05)；而OE-Tca8113 组胞活性均较WT-Tca8113 组高(P﹤0.05)。结果提示，NRP-1高表达Tca8113 细胞对射线的敏感性明显较野生型低，同样地，NRP-1 敲低Tca8113 细胞对射线的敏感性较野生型高。

综上所述，本研究首次报道了NRP-1 对口腔鳞状细胞癌放疗敏感性的影响，为后续的机制研究或药物开发提高口腔临床细胞癌放疗敏感性提供理论基础。